2.1. 微晶：生长、特性、检测

从一开始，晶体学家就致力于生长大单晶，而那些面向中子晶体学的晶体则代表了极端。因此，在过去的几十年里，已经开发了许多工具来使用越来越少的材料生长宏观晶体，典型的结晶液滴体积为50–200nl.在初始筛选设置中经常观察到的微晶簇射通常是优化方案的起点，以产生大单晶。然而，随着串行飞秒晶体学（SFX）的出现，微晶不仅本身有用，而且已经成为人们渴望的对象，而且可能需要新的工具来生长它们。为此，为了理解结晶，查看结晶相图是有用的[见图1和例如阿舍里（2004）)]. 成核发生在过饱和相，而晶体生长发生在亚稳相。因此，对于微晶生长过饱和需要建立。由于成核可能会受到限制，特别是在生长大量微晶时，使用微进给技术非常有用，这也可能增加生长同晶微晶的可能性。根据使用的数量和需要的种子数量，可以使用种子珠套件（汉普顿研究所）或BeadBug（标杆科学公司）获得微型种子。

图1 蛋白质结晶相图的简化方案。除沉淀剂浓度外，pH、温度或添加剂浓度也是重要的可调参数。指出了达到成核区和亚稳区的结晶途径。

当从已知结晶条件开始时，最方便的方法是使用分批法进行微晶化，改变初始蛋白质和沉淀剂浓度之间的比率（见图1，钻石），以及温度和pH值。分批法的优点是可以很容易地从微升缩放到毫升。如果失败，也可以使用坐滴装置获得合理数量的微晶材料。在这两种情况下，蛋白质和沉淀剂溶液的混合速度和程度会对晶体数量及其尺寸分布产生重大影响。另一种方法是通过自由界面扩散或密度离心结晶，最近对光系统II的微晶化进行了详细描述（库皮茨，格罗特约翰等。2014年).

膜蛋白是SFX的主要靶点之一结构测定因为它们经常不能产生大的衍射晶体。洗涤剂溶解的膜蛋白可以结晶在冲浪中通过混合蛋白质和洗涤剂溶液，使用上述方法获得可溶性蛋白质的微晶。使用洗涤剂的另一种选择是在添加沉淀剂之前稳定双细胞或脂质中间相中的膜蛋白在中结晶。在脂质立方相（LCP）结晶的情况下，可以通过将蛋白负载的LCP作为细柱注入充满沉淀溶液的Hamilton注射器来放大设置（Liu，Wacker等。, 2013). 这不仅有一个优点，即保持了与纳米石量筛选设置中使用的几何形状相当相似，而且还提供了一种非常方便的方法，可以在以后将微晶转移到注射器样品室中。如果将LCP糊剂注入真空中进行SFX测量，需要使用热力学稳定的LCP（如7.9 MAG所提供；Misquita公司等。, 2004)防止因蒸发冷却和脱水而形成层状相).

微晶的光学鉴定可能具有挑战性，因为晶体通常看起来是圆形的，类似于粒状沉淀。特别困难的是鉴定生长在中间相（如LCP）中的晶体。在这两种情况下，使用SONICC（手性晶体的二阶非线性成像）（Wampler等。, 2008)非常有用，因为这种方法可以识别结晶度（取决于晶体的对称性和方向），而紫外线（直接或通过双光子过程获得）可以用于区分盐和大分子。亚微米粒子可以通过纳米视距跟踪（马尔文仪器）或动态显示光散射（DLS）（库皮茨，格罗特约翰等。2014年)溶液中，或通过电子显微镜（史蒂文森等。2014年). 最后一种方法也可用于检查和优化纳米晶的质量（参见例如科恩等。2014年). 这也可以使用X射线粉末图案来完成。虽然它们的分辨率与自由电子激光中单晶衍射的分辨率不同，但它们确实显示了样品是否为晶体，并可用于评估不同晶体批次的相对衍射质量，因此例如pH值或添加剂的影响。

在SFX的背景下，我们有兴趣了解纳米晶的常见程度¹与较大的比较，以及它们是否有序。目前，回答这个问题还为时过早，但很难想象为什么合理有序的纳米晶不会长成较大的纳米晶，特别是在优化结晶溶液或改变结晶溶液范围的其他变化过程中过饱和。因此，有人建议，晶体生长因表面中毒而停止，从而形成纳米晶。随着晶体尺寸的减小，晶格缺陷和无序的影响表层变得更加主导，影响衍射特性（Dilanian等。, 2013).

2.2。样品交付

高分子晶体的特点是溶剂含量高，通常为30-80%，形成晶体接触的分子之间的相互作用相对较弱。一方面，这是好的，因为它经常赋予酶晶体催化活性，允许进行时间分辨测量。然而，另一方面，相对较弱晶格的性质使晶体对机械应力和母液温度或成分的变化，特别是脱水敏感。因此，样本交付技术需要温和，适应这些变量。进一步考虑的是上述材料的稀缺性以及进行此类实验的潜在要求真空中减少背景和/或满足检测器的需要。而传统的基于测角仪的毛细管或环形支架可用于宏观晶体（科恩等。2014年; 平田等。2014年; 苏加等。, 2015)当使用微晶进行数据收集时，需要新的方法。一种方便的方法是使用液体喷射器进行样品输送，因为液体喷射器允许将晶体高通量补充到相互作用区（见图2一). 然而，尽管实验上很简单，但瑞利射流并不适合输送高分子微晶。首先，他们使用了太多的材料，其次，考虑到蛋白结晶鸡尾酒的典型成分，冰晶形成的概率真空中相当高。幸运的是，气体动力虚拟喷嘴（GDVN）（DePonte等。, 2008)为这两个问题提供了一个优雅的解决方案。它们由一个用于液体流的直径相对较大的内部毛细管组成，周围是一个包含氦气的外部毛细管。氦鞘气流用于聚焦液体喷射，这（i）允许使用相对较大的内径毛细管进行液体输送，减少堵塞的可能性，同时仍然形成微米级液体喷射；（ii）防止结冰在真空中; 以及（iii）通过产生较小的射流来减少背景散射。数据采集期间，微晶沉淀在其存储容器中——通常需要数小时——可以通过使用旋转注射泵作为样品贮存器来避免（Lomb等。, 2012). 该设备可以通过高性能液相色谱法（HPLC）系统。基于GDVN的微晶注射（Weierstall等。, 2012)是迄今为止最成功和最普遍适用的方法，在液体中生长可溶性和洗涤剂溶解的膜蛋白晶体（Aquila等。, 2012; 查普曼等。, 2011; 格罗特约翰库皮茨等。2014年)或处于海绵阶段（约翰逊等。, 2012, 2013)被注射过。然而，考虑到喷射器持续高速运行（10 ms⁻¹)从而取代相对较大的体积（10–30µl min⁻¹)FEL是脉冲的（LCLS为120 Hz，SACLA为30 Hz），大部分材料被浪费，即它不与自由电子激光束相交。对于未来重复率很高的自由电子激光来说，这可能不是什么问题，例如汉堡的欧洲XFEL或斯坦福的LCLSII。而在探测原始样本时，快速的样本周转具有优势，这一点很重要例如在泵-探针实验中，或为了消除先前X射线照射造成的辐射损伤的影响，需要使用大量样本，因此需要大量样本。

图2 数据收集方法。(一)利用各种形式的液体射流，可以将随机取向的微纳米晶输送到X射线相互作用区域。(b条)大型冷冻冷却晶体可以安装在回路中。可以使用测角仪设置收集串行准旋转数据，逐步将晶体转换为一个值Δx个，年，实验确定的损伤区值，同时旋转Δφ是其实验测定浓度的一小部分。也可以使用芯片等其他方法。

减少样品消耗的最简单方法是放慢喷射速度。这可以通过使用高粘度晶体载体材料来实现，包括LCP，或者使用（Botha等。, 2015; 魏尔斯塔尔等。2014年)或不带（Sugahara等。2014年)保持气体聚焦方法。另一个低流速（0.1–3µl min⁻¹)液体喷射注入法是基于静电纺丝原理来聚焦液体喷射的。这种方法依赖于电场聚焦和高浓度的例如含有晶体的溶液中的甘油、聚乙二醇或蔗糖，这也有助于防止晶体在数据收集过程中沉淀（Sierra等。, 2012). 通过降低流速来减少样品消耗的另一种方法是间断注入，理想情况下与自由电子激光脉冲同步。通过这种方式，样品和X射线的传送是相互关联的。一种可能的方法是通过声波喷射液滴（埃尔森等。, 2003)，传感器由FEL触发，按需下降。这种方法的一个可能问题是液滴尺寸相对较大（2–10 nl）（Roessler等。, 2013; 苏亚雷斯等。, 2011). 液滴可直接注入X射线束，类似于液体喷射法，或沉积在X射线透明胶带上，如Kapton或Mylar，然后以传送带的方式移入X射线束（Roessler等。, 2013). 各种液体喷射装置，包括液滴，各有优缺点（Weierstall，2014）)这包括他们对样品量的要求不同以及对结晶母液成分的限制。在没有流量校准的情况下，它们具有以下优点：倒易空间，由于注入晶体的随机取向。

晶体也可以在固体支架（固定目标或芯片）上交付。原则上，这允许结晶溶液的多种成分，如果晶体位于规定位置，则命中率为100%。除非芯片在与MiTeGen微网孔支架类似的低温下使用，否则它们需要一种防止晶体干燥的方法。这可能是一层例如糖（弗兰克等。2014年)，Paratone-N（亨特等。2014年)或Kapton（Zarine-Afsar等。, 2012). 重要的是，支撑基板和屏蔽都不应显著增加X射线背景。理想情况下，某种晶体的自分选（Zarine-Afsar等。, 2011)用于通过声滴喷射（Soares）在芯片中安装或沉积等。, 2011). 使用FEL芯片进行室温测量的应用包括二维晶体分析（Frank等。2014年)由于同一晶体的X射线曝光可以在（衰减FEL）激光泵浦和晶体筛选之前和之后进行。除最后一例外倒数空间由于某些晶体形态的晶体排列(例如可能存在问题，需要弱散射表面修改（Zarine-Afsar等。, 2012). FEL脉冲产生的冲击波对邻近窗口的影响需要研究（帕迪尼等。2014年).

3.1. 衍射数据采集

XFEL就其本质而言，可以产生带宽相对较窄的飞秒X射线脉冲。这对衍射数据的获取有影响，因为晶体与X射线束的相互作用只是短暂的。因此，不可能在曝光期间旋转晶体以收集产生完全积分反射的常规振荡或旋转数据。相反，仅获得部分反射。此外，相对较窄的带宽降低了多色劳厄方法在跨越中的有效性互易空间记录完全集成的反射。

数据收集策略取决于使用的是非常小的晶体还是很大的晶体。宏观晶体可以在XFEL数据采集之前根据分辨率、镶嵌性和方向进行表征等。该信息可用于设计优化的晶体特定准旋转数据采集协议。例如，从高度辐射敏感的牛细胞色素的还原形式中收集高分辨率衍射数据c（c）氧化酶（平田等。2014年)或来自光系统II（Suga）未受损的含氧复合物等。, 2015)，大型低温晶体被安装在测角仪上，并在SACLA以连续方式曝光。连续暴露不同于Δφ和逐步翻译Δx个，年分别由实验确定的镶嵌性和损伤区值指导（见图2b条). 因此，在这种方法中，可以将其描述为串行飞秒旋转晶体学（SF-ROX）（Schlichting，2015)，晶体的方向对于每个单独的曝光都是已知的，并且可以使用常规处理程序进行数据分析。当使用非常小的晶体进行XFEL数据采集或其他方案时，情况并非如此，这些方案在FEL暴露时会导致晶体破坏。如果晶体暴露在如此高的温度下通量密度（辐照度）暴露后会被破坏，需要用另一未知随机方向的新晶体进行补充。

如§2.2所述，可以使用液体微射流、液滴或固定目标（如芯片）将晶体输送到自由电子激光束中衍射数据是以自由电子激光重复率、探测器帧速率或样品补充率设置的速度采集的，无论速度限制如何。自由电子激光脉冲在液体微射流、液滴或固定靶装置中击中晶体的概率取决于晶体浓度。因此，收集到的衍射图案不仅包含所需的单晶碰撞，而且还包含空弹或多晶体碰撞。因此，数据分析的第一步包括识别晶体衍射图案，这是一个称为“命中发现”的过程。为此，利用布拉格峰的鲜明鲜明特征，并设置阈值（通常为10-30个峰值）来识别点击。这个数据挖掘步骤可以使用程序离线执行猎豹（巴蒂等。2014年)或货运财务结算系统（福卡等。, 2012)并且所得到的命中可以被馈送到随后的分析程序中。货运财务结算系统也可用于数据采集期间的在线分析。例如，绘制命中率有助于优化液体射流在自由电子激光束中的位置，显示饱和像素数有助于调整通量通过正确选择衰减器，并以虚拟粉末图案的形式总结布拉格峰，提供了快速判断数据完整性的方法。

一般来说，SFX数据集由大量独立的快照或静态衍射图案组成，每一个都是从一个随机定向的晶体中收集的，该晶体在飞秒X射线照射期间有效地静止不动，最终将其破坏。晶体不仅在方向上不同，而且在大小和质量上也不同。这会影响记录的衍射强度，这也取决于晶体是位于X射线束的外围还是中心，以及X射线脉冲的能量是高还是低。所有这些，以及变化光谱分布自我完善的自发辐射（SASE）自由电子激光束，导致记录的强度有很大波动。SFX数据的索引也可能具有挑战性，特别是在小晶胞的情况下，因为与旋转数据相比，布拉格反射的数量可能显著减少。晶体衍射数据的索引中还出现了更复杂的情况，其中晶体的对称性Bravais晶格高于空间组。这导致27个空间组的索引不明确[参见Brehm&Diederichs（2014）)和白色等。(2013)列表]。对于要与其他数据集合并或比较的每个数据集，必须在可能的索引模式之间作出决定，这对于传统（部分）数据集来说不是问题。在SFX数据的情况下，必须对每个衍射图案作出决定，失败会导致数据集出现完美孪晶（50%）。由于所有这些原因，SFX数据缩减需要专门的分析程序。

3.2. SFX数据分析

目前，有三个不同的项目[CrystFEL公司（白色等。, 2012; 白色等。, 2013),cctbx.xfel公司（哈特纳等。2014年; 索特等。, 2013)和nXDS公司（卡布施，2014年)]可用于分析串行衍射数据，并且它们的方法和算法不同。CrystFEL公司，第一个可用的，依赖于其他程序[例如 猎豹（巴蒂等。2014年)或货运财务结算系统（福卡等。, 2012)]用于识别命中率。CrystFEL公司识别点击中的Bragg峰值，并将反射列表传递给MOSFLM公司（鲍威尔等。, 2013)或迪拉克斯（杜伊斯伯格，1992年)用于索引和积分，并以蒙特卡洛方式合并部分衍射强度（基里安等。, 2010, 2011). 对于数据集中包含的所有衍射图案，确定了一个通用的分辨率极限。这种方法会导致相对较高的WilsonB类这些因素包括：相对较低的信噪比，高分辨率壳体中观测的高度完整性和多样性，因为可能包含弱反射，甚至来自衍射差或弱晶体图案的噪声。相反，两者都是nXDS公司和cctbx.xfel公司分别确定每个衍射图案的分辨率截止值，这将导致高分辨率范围内反射的低多重性和高信噪比以及低威尔逊B类因素与CrystFEL公司.同时nXDS公司使用全局缩放、轮廓拟合和后期优化CrystFEL公司也不是cctbx.xfel公司现在还没有。使用这两种方法分析的SFX数据的系统比较CrystFEL公司和cctbx.xfel公司最近发表的文章指出了这些和其他差异（Sawaya等。2014年).nXDS公司生成于XDS公司（卡布施，1988年)，但它有许多新功能，可以明确处理上述SFX数据的属性。特别地，nXDS公司不依赖蒙特卡罗方法进行积分。索引后，反射的像素内容映射到埃瓦尔德球体，接下来是假设高斯摇摆曲线的轮廓拟合。不使用偏倚的概念，而是引入了一个Ewald偏移校正因子，用于估计反射与埃瓦尔德球体。这允许对全球标度原始强度的所有衍射和标度参数进行后细化，以导出结构因子振幅。

已经开发了三种方法来解决衍射图案的索引模糊性，在晶体具有较低的点编组而不是晶格对称性。nXDS公司使用与参考数据集的相关性，或者在没有相关性的情况下，使用选择性繁殖算法。Brehm&Diederichs（2014年)使用模式的成对关联和以相同方式索引的模式的聚类。该方法已在水晶EL和cctbx.xfel公司Liu&Spence（2014年)提出了一种基于期望最大化算法的算法，并在仿真数据上进行了测试。

3.3. SFX数据的质量

考虑到SFX固有的许多波动，数据质量尤其重要。这是使用建立良好的溶菌酶模型系统进行分析的，该系统产生衍射良好的宏观和微观晶体。对LCLS和瑞士光源分别收集的高分辨率SFX和传统旋转数据集进行比较，结果表明衍射强度及其统计数据以及精细模型（Boutet等。, 2012). 同步加速器测量是使用一个在室温下保持的大单晶进行的，总剂量为24 kGy，而SFX测量是使用溶菌酶微晶的微晶浆料进行的，该微晶浆液通过液体喷射注入FEL束。对大约20000个单独的衍射图案进行了索引和缩放，每个衍射图案都来自一个随机取向的晶体，该晶体在40或5 fs的自由电子激光脉冲长度下分别经历了33或2.9 MGy的剂量。重要的是，使用同步加速器和FEL数据绘制的不同电子密度图[F类_{光突发事件}（SLS）−F类_{光突发事件}（LCLS）]无辐射损伤迹象。蛋清溶菌酶（HEWL）的结构由分子置换使用土耳其溶菌酶模型，在侧链变异的情况下，电子密度存在明显差异。此外，S桥中的硫原子是不同的，符合1.9º（Boutet等。, 2012).

虽然SFX数据足够好，可以观察到不属于模型的新结构特征（Redecke等。, 2013)，以及两种硫的异常差异（巴伦兹等。, 2013)和金属（Barends等。2014年; 科恩等。2014年)，他们似乎没有达到同步加速器数据的质量。考虑到实验中的所有波动[X射线（光子能量和光谱分布，脉冲能量）、晶体（尺寸、质量）甚至探测器（增益、计量）]，这可能有很多原因，其中大多数原因没有很好地描述。因此，在一个明确的控制实验中，Kabsch（2014）旨在测试合并大量静态衍射图案的影响)分析了一个精细切片(Δφ=0.02°）硒代蛋氨酸标记蛋白晶体的同步加速器数据集，由20000个连续旋转图像组成，使用XDS公司（连续图像）和nXDS公司（随机图像）。这些结果显示出良好的一致性，尽管索引不明确，但索引正确（晶体P（P）4_三空间群对称性，低于422晶格对称性，意味着双重索引模糊性）和允许的强异常信号从头开始的在这两种情况下都分阶段进行。然而，nXDS公司导致平均信噪比下降了近三倍XDS公司.精度较低nXDS公司可能是由于二维而非三维剖面拟合以及缺乏其他尚未实施的校正造成的。

直觉上，人们会认为这种变化会产生巨大的影响光谱分布但在比较用SASE（波动多色分布）或种子（或多或少单色）束（Amann）收集的溶菌酶微晶的SFX数据时，情况似乎并非如此等。, 2012)并用CrystFEL公司（酒吧等。, 2015). 该结果指出了数据中的其他错误源。在传统的大分子晶体学中，合并来自几个晶体的数据是一种常用的方法，以减轻辐射损伤的影响。要特别注意合并哪些部分数据集以考虑例如非同构（Foadi等。, 2013)，特别是对于单波长反常衍射（SAD）定相（Liu等。, 2012; Liu、Liu和Hendrickson，2013年). 虽然到目前为止，使用蒙特卡罗方法的SFX数据并非如此，但当将溶菌酶SFX数据分类为不同的单位-细胞分布组（Barends）时，并未观察到对数据质量的影响等。, 2015).

3.4. 阶段化

晶体学的结构测定需要恢复衍射强度测量过程中丢失的相位。传统的相位调整方法依赖于重原子散射体的贡献，例如多个或单个散射体同晶置换方法和/或多波长或单波长异常衍射（MAD或SAD）测量，利用X射线吸收边缘的元素特定散射。这些方法没有理由不适用于SFX数据。事实上，最近的研究表明，不仅可以测量蛋白质中内源硫原子的微弱反常衍射（Barends等。, 2013)而且SFX数据对于SAD分阶段来说足够准确（Barends等。2014年). 为此，收集了溶菌酶重原子衍生物的高多重性2.1º分辨率SFX数据集，该数据集在每一个样品中从两个钆原子发出强烈的反常信号非对称单元（吉拉德等。, 2003). SFX数据（Kirian）如预期等。, 2010, 2011; 白色等。, 2012)，数据质量在很大程度上取决于集成模式的数量。虽然这两个钆原子可以使用数千个索引模式在相控图中轻松找到下部结构和从头开始的只有当所有～60000个模式都被使用时，才可能进行阶段化，从而产生极好的值R（右）_分裂以及高异常相关系数科科斯群岛_阿诺0.48（Barends）等。2014年).

而钆衍生物允许从头开始的由于两个钆原子发出强烈的反常信号，相位调整非常困难。使用异常差异对SFX数据进行相位调整具有挑战性的原因有几个，包括信号幅度小、来自非同晶晶体的数据可能合并、，在测量多重性较低的情况下，Friedel对的测量不正确，这将导致人为的较大异常差异，重要的是，缺乏对误差的良好测量[σ(我)]强度，特别是在使用蒙特卡罗方法进行积分时。然而，SAD方法依赖于测量振幅的良好误差模型（McCoy，2004; 麦考伊等。, 2004).

针对SFX数据提出了新的相位调整方法，该方法明确利用了FEL辐射的独特特性。自由电子激光束的相干性质允许测量纳米晶衍射图案中的布拉格间强度（查普曼等。, 2011)由有限晶体的晶型变换函数与布拉格峰的卷积引起，由分子变换调制。而不完全单位细胞的影响（基里安等。2014年)或表层捐款（Dilanian等。, 2013)使情况复杂化的是，这种方法允许通过过采样技术进行相位调整，利用从衍射图案导出的形状变换函数（Spence等。, 2011)或布拉格位置衍射强度的梯度，导致峰值的微小偏移（Elser，2013)Millane&Chen（2014). 高峰光辉FEL可用于辐射诱导相位的变化（巴努马蒂等。, 2004; 拉韦利等。, 2003)特别是利用自由电子激光的高注量，通过重原子的多次电离对靠近内壳层吸收边缘的光子能量造成重大的电子损伤。重原子在K（K）边缘变化取决于波长和强度，可用于高强度MAD阶段使用修正的Karle–Hendrickson方程（Son等。, 2011). 计算中假设电子变化仅适用于吸收重原子，影响其反常散射行为，但情况可能并非如此。特别是，布拉格终止效应可能会改变高分辨率和低分辨率反射之间的强度分布（Barty等。, 2012; 伦布等。, 2011)从而引入了明显的非同构。

3.5. 辐射损伤

从一开始，辐射损伤就一直困扰着大分子晶体学（Blake&Phillips，1962). 这对于研究氧化还原敏感系统，如金属蛋白-与光系统II（PSII；Yano等。, 2005)成为海报上的孩子——以及一般纳米到微米级晶体（Holton&Frankel，2010）). X射线自由电子激光，由于其峰值光辉和飞秒脉冲，已经被提出作为解决这个问题的方法，允许衍射-预破坏的方法超越辐射损伤（Neutze等。, 2000). 虽然这似乎适用于每晶体30–150 MGy的“中等”剂量（Boutet等。, 2012; 科恩等。, 2013)，高剂量的情况似乎并非如此（巴蒂等。, 2012; 伦布等。, 2011). 溶菌酶微晶衍射数据（Lomb等。, 2011)和光系统I（PSI）（Barty等。, 2012)观察到数个GGy剂量。这两项研究一致认为这一观察的根本原因是，大脑皮层的分辨率依赖性紊乱晶格与曝光时间有关。然而，他们得出了不同的结论。假设原子/元素在单位电池，巴蒂等。(2012)得出的结论是，FEL诱导的无序对衍射起到了闸门作用，在脉冲开始时收集的未受损高分辨率强度叠加在脉冲结束时日益受损的低分辨率强度上，并可通过Wilson型标度进行校正。Lomb期间等。(2011)他们同意全球损害的这一根本原因，预测存在局部损害热点，这些热点以无法纠正的方式恶化了数据。由于数据的解析妨碍了进一步分析，目前正在探讨这个问题。

实验确定了低温（30 Mgy）下同步加速器数据采集的安全剂量限值（Owen等。, 2006)和室温（0.2 MGy）（欧文等。, 2012)但对于自由电子激光提供的飞秒曝光和剂量率，这些实验确定的数字缺失。根据计算，查普曼及其同事推断，对于典型的蛋白质晶体，每个原子在FEL脉冲结束时以400 MGy的剂量电离一次（查普曼等。2014年). 因此，在脉冲期间，光子更有可能从中性原子散射，而不是从电离原子散射。在较高剂量下，预计脉冲积分衍射将受到电离的影响。

4.1、。技术的交叉受精

有趣的是，出于必要为自由电子激光开发的SFX数据收集方法现在正在用于同步加速器源的串行数据收集。动机是类似的，一种高通量高剂量率的方法，用于使用未衰减的X射线束从小的或弱散射的晶体中收集数据。考虑到新鲜晶体的持续供应，每次单晶暴露都可以使用完全可耐受剂量。为此，开发了不同的方法：（i）悬浮在环中的低温结晶浆液（Gati等。2014年); （ii）毛细血管中的晶体浆液（Stellato等。2014年); （iii）芯片安装（Zarine-Afsar等。, 2012); 和（iv）高粘度挤压注射器（Botha等。, 2015). 在前三种情况下，样品架（环、毛细管、芯片）依次通过X射线束移动，而在情况（iv）中移动的是高粘度载体介质。高粘度介质，如LCP或润滑脂（Sugahara等。2014年)适应极长的曝光时间（同步加速器的毫秒数与通过缓慢地将晶体穿过X射线束，同时避免不必要的旋转，从而涂抹衍射峰。这种方法具有暴露原始样本的优点，这不仅对减少损伤影响很重要，而且对时间分辨的泵-探针测量也很重要。在瑞士光源使用这种基于高粘度挤出注射的串行晶体学（SX）方法获得的第一个结果，包括从头开始的阶段划分，已由Botha描述等。(2015). 虽然所有的SX方法都需要进一步发展以减少背景散射，但它们是FEL数据收集的一个有趣的替代方案，用于研究环境温度下大分子的结构和动力学，特别是考虑到探测器和同步辐射源的不断发展(例如衍射光存储环和“粉色”光束）。

总之，大分子晶体学的未来是非常光明的。