1.简介

在小角度散射（SAS）研究中，使用X射线或中子探测物质的纳米结构。该技术适用于完全或部分无序物体，特别适用于研究接近天然溶液和药物配方中的生物大分子（Svergun等。, 2013). 在SAS实验中，散射强度我来自稀释溶液高分子(例如蛋白质，核酸类或复合物）。由于分子是随机取向的，因此对单个粒子的散射轮廓进行平均，从而产生各向同性强度我(秒)作为动量传递的函数秒=4π罪θ/λ，其中2θ是散射角和λ是辐射波长（图1). 尽管如此，即使从这些一维散射剖面，也可以重建整个粒子结构的三维模型。这可以在没有任何附加信息的情况下通过从头算方法（Chacón等。1998年; 斯维尔贡，1999年, 2001; Franke&Svergun，2009年)或通过混合建模，利用已知的域或亚基原子结构构建复合物模型（Petoukhov&Svergun，2005).

图1 FSC方法概述，用于估计结构集合的可变性。首先，多次运行从头算此处所示的溶菌酶建模是为了根据给定的散射强度分布生成一系列模型我(秒) (秒=4π罪θ/λ，其中2θ是散射角和λ是辐射波长）。然后，对重建的珠子模型或哑弹模型进行结构对齐，并计算其成对FSC函数。所有成对FSC函数的平均值用于确定可变性估计Δens公司作为2π/秒ens公司，其中秒ens公司是平均FSC降至0.5以下的动量传递值。使用线性回归模型根据可变性估计相应的分辨率。

从溶液散射剖面获得三维模型的可能性，以及仪器的最新进展，为现代同步加速器的高通量研究铺平了道路（佩诺等。, 2013; Acerbo公司等。, 2015; 布兰切特等。, 2015; 比齐安等。, 2016)在过去十年中，SAS在结构生物学中的普及程度大大提高。根据PubMed的统计数据，过去十年中，致力于生物溶液散射的出版物增加了近四倍，这表明SAS在结构生物学领域的复兴。然而，有两个主要的未解决问题阻碍了该方法成为一种成熟的结构生物学技术。一方面，由于SAS数据中的信息量受到球面平均值的限制，重建三维结构模型具有固有的模糊性，可以获得与实验数据同样吻合的模型集合。另一方面，作为一种低分辨率方法，SAS不提供原子级的信息。通常，基于SAS的模型默认分辨率为～10–20 但是没有客观的解决方法。这种情况与结构技术（如大分子X射线晶体学（MX）和电子冷冻显微镜（EM））形成了对比，后者的分辨率标准得到了很好的确立。

对于MX，分辨率根据布拉格定律取决于从背景中检测到的进入结构的最高阶衍射峰的倒数精炼（布拉格和布拉格，1913年). 应用该原理从最大动量传递值推导分辨率秒_最大值用于生成SAS模型的仅给出标称理论极限（2π/秒_最大值)由于SAS重建的模糊性，没有太大的实用价值。EM数据的分辨率通常通过傅里叶壳相关（FSC）方法进行估计，其中比较了从两组单独处理的实验图像重建的电子密度图互易空间（van Heel&Stöffler-Meilicke，1985年; Saxton&Baumeister，1982年; Harauz&van Heel，1986年). 分离为两个独立的数据集显然不适用于SAS，因为只有一个实验散射剖面可用，并且由于Shannon采样，实验SAS数据是相互关联的（Shannon&Weaver，1949). 另一种主要的结构方法，核磁共振波谱（NMR），产生了与实验核磁共振数据兼容的原子模型集合。虽然核磁共振模型没有商定的分辨率标准[例如模型之间的平方根偏差（r.m.s.d.）有时可能会高估分辨率；蒙特利奥内等。, 2013; 修道院等。, 2014]立体化学验证有助于评估模型质量。这种基于验证的方法也适用于MX结构（Read等。, 2011; 多雷利耶斯等。, 2012; 贝尔扬斯基等。, 2012)，不能用于解决方案散射，因为SAS模型不显示原子细节。

在从头算使用SAS数据进行形状重建，使用有限体积元素表示三维模型，例如密密麻麻的珠子（Svergun，1999; Franke和Svergun，2009年)或假残留物（DR；Svergun等。, 2001). 重建从体积元素的随机配置开始，并使用优化算法(例如蒙特卡罗模拟退火），以将模型的计算理论散射拟合到实验SAS剖面。除了拟合的差异外，目标函数还包括确保模型物理可行性的约束，如互连性和紧凑性。多个从头算从不同随机配置开始的重建产生了具有相似整体外观的不同模型，每个模型与实验SAS数据一致。通常，进行10到20次重建，并使用成对归一化空间差异（NSD；Kozin&Svergun，2001）对模型（包括给出完全相同散射图案的对映体）进行叠加). 选择平均NSD最小的模型（或对映体），其他模型与之对齐，并对结果图进行平均。平均模型已被证明能够保留所有重建中最持久的特征（Volkov&Svergun，2003). 然而，平均程序没有提供分辨率评估，因为与NMR系综相比，多个SAS模型不具有一对一的原子或残基对应关系，并且不可能计算r.m.s.d.值。

缺乏客观标准来评估SAS模型的分辨率是一个严重的缺陷，这阻碍了对结果的批判性评估，特别是考虑到SAS在结构生物学中的日益使用以及SAS模型在档案中的沉积（Hura等。, 2009; 瓦伦蒂尼等。, 2015). 为了将SAS模型与其他实验技术获得的结构结果进行有意义的比较，需要一个定量的分辨率度量。在这里，我们提出了一种估计分辨率的方法从头算SAS通过分析与SAS数据兼容的模型集合中的FSC函数导出形状。结果表明，反映模型可变性的集合上的平均FSC函数可以与形状重建中单个模型的分辨率相关。该方法在一个公开可用的计算机程序中实现，并通过对合成数据的一系列测试和实际示例证明其实用性。

2.SAS模型可变性的FSC测量

首先，我们引入了一个可变性度量从头算SAS模型由珠子或DR组成。鉴于这些模型中体积元素的编号是任意的，两个不同模型中的珠子或RD之间不存在直接对应关系。因此，一般的实空间测度很难定义，并且傅立叶变换的使用是合适的。类似于EM的FSC功能（van Heel和Stöffler Mericke，1985; Saxton&Baumeister，1982年; Harauz&van Heel，1986年)中，我们使用了两个结构模型在相应壳体上的散射振幅之间的归一化互相关系数倒易空间。如果A类和B类是两个具有已知结构的（适当对齐的）实体A类(秒)和B类(秒)是它们的三维散射振幅（这里，秒是倒数空间中的散射矢量）、一维FSC是动量传递（也称为空间频率）的函数，

其中(秒,Δ秒)是球壳的半径和宽度倒易空间。散射振幅从头算模型A类和B类可以表示为互易空间使用球面谐波展开，

哪里秒= (秒,Ω)是球坐标系中的散射矢量，A类_勒姆(秒)和B类_勒姆(秒)是模型的部分散射振幅A类和B类,L（左）是定义展开精度的截断值Y（Y）_勒姆(Ω)是有序的球面谐波(我,米)（斯图尔曼，1970). 使用形状系数计算局部振幅（f）_k(秒)珠子或假残渣，并使用方程式

哪里j个_我(锶)是球形贝塞尔函数。替换散射振幅的球谐表示[方程（2）]和（3）]到（1）利用球谐函数的正交性，FSC功能变为

哪里我_A类(秒)和我_B类(秒)是模型的散射强度A类和B类.

对于非相同结构，FSC随动量传递而减小，反映了结构相似性随分辨率增加而损失。FSC通常用于EM，用于比较两个密度图以估计地图分辨率，该分辨率定义为FSC函数值低于某个阈值的空间频率。FSC函数通常单调减小，但也可能观察到局部振荡，可以通过选择适当的球壳宽度来抑制这种振荡Δ秒[方程式（1)].

如上所述从头算形状测定通常在SAS中进行，然后可以获得一组（通常为10-20）对齐模型，每个模型都与实验数据一致。为了量化从头算系综，计算对齐模型的散射振幅，并使用（1）评估成对FSC函数。然后可以使用这些FSC函数的平均值来获得可变性度量Δ_ens公司（图1). 对于EM图，通常使用FSC函数中的中点（0.5）阈值来定义分辨率，尽管也讨论了其他值（van Heel&Schatz，2005; 彭泽克，2010年). 我们对随机模型的计算（§S1，支持信息）证实，FSC的中点确实提供了与随机化幅度一致的分辨率度量。因此，在随后的计算和可变性测量中采用了0.5的FSC阈值Δ_ens公司定义为2π/秒_ens公司从动量传递值秒_ens公司平均FSC值降至0.5以下。请注意，两两FSC的平均值可抑制单个FSC函数中观察到的振荡，从而提高秒_ens公司集合的估计（图1).

2.1. 变异性和基准蛋白集

分析变异性估计的特性Δ_ens公司，我们表演了从头算对107种分子量范围广泛（7到670之间）的基准蛋白质合成SAXS数据集进行建模 蛋白质数据库（PDB；Fox）中已知高分辨率结构的低聚物状态和SCOPe折叠等。, 2014; 伯曼等。, 2003; 补充表S1和S2）。使用Zingg的粒子形状分类将这些结构标注为扁圆形、长圆形或等长（Zingg，1935）). 合成SAXS配置文件我(秒)为每个基准生成CRYSOL公司使用高达18阶的球谐函数、17阶的斐波那契网格以及溶剂密度和水合层对比度的默认参数（斯维尔根等。, 1995). 然后确定距离分布函数第页(第页)对于每个数据集，使用GNOM公司（Semenyuk和Svergun，1991年)和形状重建达米夫（胎圈型号）或GASBOR公司（灾难恢复模型）。考虑到包含整体形状信息的散射数据范围与粒径成反比达米夫重建在（0，7.0）范围内进行/R（右）_克)，其中R（右）_克是回转半径蛋白质的含量。散射剖面的低角度部分，对应于大约五个香农通道（香农和韦弗，1949年)，包含整体形状信息，此范围通常用于形状确定。GASBOR公司使用更详细的虚拟残留物表示进行重建可以利用更高分辨率的数据，并且使用固定的秒_最大值值为0.5 Å⁻¹，这是一个典型的实验SAS数据范围。对于每个蛋白质，生成20个重建，使用SUPCOMB公司（Kozin和Svergun，2001年)使用上述FSC方法计算了系综内的变异性。在基准集的蛋白质中，计算出的变异性在7.2到38.0之间 对于珠子模型，λ介于9.0和47.8之间 对于DR模型（图2）).

图2 之间的关系Δens公司和Δ科科斯群岛基准蛋白质假珠的值(一)和哑巴(b条)合奏。这两个量显示了两个珠子的线性相关性（皮尔逊相关系数 第页=0.80）和dummy-resideue（皮尔逊相关系数 第页=0.86）模型。SAS分辨率值可通过线性回归模型估算（珠子模型，分辨率=0.96Δens公司+ 7.7; 虚拟-残留模型，分辨率=1.10Δens公司+ 5.8; 红色实线）。95%置信区间用红色虚线表示，95%预测区间用蓝色虚线表示

此外，可变数据范围用于15种基准蛋白的子集，以便产品秒_最大值·R（右）_克等于5.0、7.0或9.0（补充表S5）。对于GASBOR公司建模，两个固定秒_最大值值，0.5和1.0 Å⁻¹使用了。此外，从小角度散射生物数据库（SASBDB；Valentini）检索到一组实验SAXS剖面等。, 2015; 补充表S9和图3），以测试典型实验数据范围的可变性方法。20个独立从头算 达米夫和GASBOR公司使用选定的数据范围和程序的默认参数为每个蛋白质生成模型。

3.从可变性到分辨率

整体可变性是形状重建再现性的度量，其本身并不提供重建模型的分辨率（这是对其准确性的度量，即它们与“真正的结构”有多接近）。问题是这两个量是否以及如何相互关联。为了回答这个问题，我们计算了基准蛋白的已知高分辨率X射线晶体结构和从头算生成的信号群中的模型（补充表S1和S2以及补充图S1和图S2）。互相关分辨率Δ_{科科斯群岛}系综的实际分辨率是SAS模型的实际分辨率，该模型基于与相同蛋白质的已知高分辨率结构的比较，该结构由平均成对FSC函数在0.5的截止点处确定。对于每个从头算模型对映体选择与PDB中的参考原子模型进行更好的对齐。

对于所分析的所有蛋白质，Δ_{科科斯群岛}被发现系统性地比整体变异性大一些Δ_ens公司（补充表S1、S2和图2). 这个Δ_{科科斯群岛}基准数据集中的系综值在13.5到52.2之间 对于珠子模型，Ω介于13.4和76.0之间 对于DR型号，为“o”。最重要的是，可变性度量Δ_ens公司和交叉验证的分辨率Δ_{科科斯群岛}证明了良好的相关性，如图2所示这两个参数与皮尔逊相关系数之间的线性关系可以很好地描述相关性第页=0.80适用于达米夫模型和第页=0.86适用于GASBOR公司模型。采用基于基准数据的珠状和哑铃状集成的独立线性回归模型，从集成变化中预测SAS分辨率Δ_ens公司.观察到的Δ_ens公司和Δ_{科科斯群岛}允许直接估计从头算系综变化的模型Δ_ens公司作为

其中系数β是表示响应系综变异性变化的分辨率预期变化的斜率Δ_ens公司、和α是一个常数，表示零变化时可达到的分辨率极限。系数β0.96±0.07和1.10±0.09以及恒定值α（7.7±1.3） ？和（5.8±1.2） 为找到了“”达米夫和GASBOR公司模型。新观测值和拟合函数的95%置信区间使用逆函数计算t吨统计n个− 2自由度，具有n个是数据对的数量（图2). 所有统计分析均采用MATLAB软件（Mathworks公司）。

由于受到互连性和紧凑性等约束，集合可变性系统地小于模型的实际分辨率从头算建模。这些约束限制了可用的构象空间，从而提高了模型的一致性并减少了系综变化（§S2，支持信息）。然而，必须强调的是，这些约束非常温和，总是以预定义的方式应用，不会导致数据不匹配或结果模型不准确。因此，从一个重建到另一个重建，可变性和分辨率之间的既定关系保持不变。有趣的是，对于珠子和DR建模，线性相关性都被一个常数所抵消(α)，可以将其合理化为即使在理想情况下也始终存在的可变性，即基于SAS的最佳分辨率从头算形状重建（约7-8 O表示珠子造型，5–6 用于DR建模的是“o”）。不同的偏移值还与以下事实密切相关：结构模型中最小体积元素的大小限制了可获得的最大分辨率，并且与哑弹模型相比，珠子模型具有更粗粒度的表示。我们应该注意到达米夫（水化层包含在珠子模型中）和GASBOR公司（显式虚拟水分子）对可变性和分辨率之间的关系影响很小。

对于珠子建模，观察到一些数据点超出95%置信区间（图2一). 所有这些都是具有内部空腔或孔洞的寡聚蛋白结构（§S3，支持信息）。珠子建模过程总是试图建立与实验数据相兼容的最低复杂度模型，因此往往会模糊更精细的细节。这自然会增加Δ_{科科斯群岛}并解释提升的Δ_{科科斯群岛}/Δ_ens公司这种结构的比例。有趣的是，基于DR的建模没有这种影响，它利用了更高的角度数据，因此可以更好地表示更复杂的形状（图2中没有观察到异常值。2b条).

为了进一步验证所提出的方法，我们对25个合成数据集进行了折刀测试，这些数据集取自PDB中未包含在原始基准集中的结构已知的蛋白质（图3和补充表S3）。使用可变性度量Δ_ens公司在珠子和DR模型系综中，我们用（6）预测了有效分辨率并将其与相互关联的分辨率值进行了比较Δ_{科科斯群岛}。比较得出了良好的相关性第页珠模型和DR模型分别为0.84和0.97，表明通过变异性计算分辨率的高保真度。

图3 交叉验证分辨率之间的比率Δ科科斯群岛以及折刀集（蓝色圆点）和实验数据集（红色圆点）的估计SAS分辨率，作为分子量的函数达米夫珠子模型(一)和GASBOR公司哑弹模型(b条).

4.决议评估的实施和测试

FSC估算模型分辨率的方法包括四个步骤：（i）从头算根据给定SAS剖面重建的模型，（ii）计算对齐模型的散射振幅，（iii）使用球面谐波评估成对FSC函数，以及（iv）根据成对FSC函数的平均值确定模型可变性和分辨率（方程6以及补充图S1和S2）。模型对在结构上使用SUPCOMB公司（Kozin和Svergun，2001年)或苏丹（科纳列夫等。, 2006)对于系综内所有可能的模型对，使用球面谐波计算FSC。因此，对于从头算模型，N个(N个−1）/2进行FSC比较。使用宽度为的滑动窗口计算和平滑平均FSC函数Δ秒= 0.1 Å⁻¹，相当于中壳体的标准宽度互易空间(Δ秒=0.08 Å⁻¹)用于EM FSC计算（谢赫等。, 2008). 可变性测量Δ_ens公司定义为2π/秒_ens公司，其中秒_ens公司是平均FSC降至0.5以下的动量传递值。同样，交叉验证的分辨率Δ_{科科斯群岛}的从头算使用相同的阈值，通过FSC与参考高分辨率结构的比较获得系综。

5.结论

通过结构方法（如MX和EM）获得的大分子模型总是在出版物中报道并保存在公共档案馆中（伯曼等。, 2003)以及它们的分辨率，这是与模型质量相关的一条极其重要的信息。近十年来，SAS在结构生物学领域取得了巨大进展，它已成为结构生物学的主流方法，这得益于新的实验可能性和从一维SAS数据重建三维模型的新型数据解释方法。SAS生成的模型现在通过专用档案（Hura）提供给社区等。, 2009; 瓦伦蒂尼等。, 2015). 然而，到目前为止，还没有可用的标准来量化由SAS数据构建的模型的分辨率，这使得很难有意义地利用这些模型来回答生物学问题。

一维数据三维重建的固有模糊性是SAS的主要问题之一，因为可能会生成多个（尽管在低分辨率下相似）模型，从而产生基本相同的散射剖面。在这里，我们证明了这种模糊性在确定从头算形状建模。介绍了一种基于与给定数据集兼容的重建集合内平均FSC函数分析的分辨率度量。使用大量模拟和实验数据集，可以看出从头算模型与集合中模型的可变性直接相关。在标准SAS应用程序中，多个从头算使用游程平均形状并找到最可能的重建。根据定义，后一个模型与集合的其他成员的整体形状差异最小。鉴于基于FSC的测量值反映了该集合的平均值，FSC的分辨率评估应归因于最可能的重建，这也是出版物中通常报告的模型。基于FSC的分辨率度量为分析从头算SAS模型表示，无法自信地解释比分辨率更精细的结构特征。当然，人们不应该忘记重建物体对映模型的可能性。对映体在排列和平均过程中被自动考虑（Kozin&Svergun，2001; Volkov&Svergun，2003年; 科纳列夫等。, 2006)相应地，在FSC功能分析中。

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