2.1. 半乳糖凝集素-3

中子数据的采集分辨率为1.7Ω，从1.8 mm^三在法国格勒诺布尔劳厄-朗之万研究所（Blakeley）使用LADI-III仪器将半乳糖凝集素-3（半乳糖凝蛋白-3C）的全氘化碳水化合物再认识域晶体与非中和乳糖络合等。, 2010). 在瑞典隆德的MAX-II同步加速器上，从束线I911-3上的同一晶体中收集到1.0º分辨率的X射线数据。数据收集和处理的详细信息已在前一篇文章中介绍（Manzoni等。, 2016). 在那篇文章中，这里使用的中子数据集被称为“乳糖2”，完成率为87.1%，分辨率为1.7°（完成率为66.5%，分辨率为1.8°至1.7°）。X射线数据完成率为99%，分辨率为1.0º。然而，在本文的所有改进中，X射线数据被截断为1.7°分辨率。这主要是因为程序用于精细化， 加拿大国家统计局（见下文），无法细化各向异性B类因素。然而，它也反映了一种比半乳糖凝集素3C更常见的情况，即X射线和中子衍射极限更相似。此外，高分辨率X射线数据包含有关氢位置的信息，这可能与中子数据相矛盾，因为电子密度的峰值向重原子的键中心偏移，导致键长度更短。对具有更高分辨率X射线数据的场景进行了LPMO测试。最终发布的半乳糖凝集素3C-乳糖结构（Manzoni等。, 2018)，作为条目存放在PDB中6亿根据一个更完整的中子数据集（96%完成，分辨率为1.7º）进行了改进，通过合并来自两个晶体（Manzoni）的数据获得了更高的多重性等。, 2016).

的起始结构精炼半乳糖凝集素-3与乳糖复合物的0.86μl分辨率X射线结构（Saraboji等。, 2012). 首先根据X射线数据对结构进行了优化，使用REFMAC公司5（穆尔舒多夫等。, 2011). 当在1.7Å分辨率下可见时，手动添加水分子。乳糖分子的几何约束产生于菲尼克斯·埃尔博.联合X射线/中子精炼然后使用执行菲尼克斯定义（阿富宁等。, 2012). 所有计算都是在隆德大学LUNARC Aurora集群的Intel Xeon E5-2650处理器的一个内核上进行的。

常规接头收敛时精细化，用中子晶体学补丁对最终结构进行了50步的精细化结晶和核磁共振系统（布伦格等。, 1998)软件(加拿大国家统计局; 亚当斯等。, 2009)QM之前精细化。我们使用了标准加拿大国家统计局所有原子的MM力场(蛋白质-allhdg_d.param和国防部参数). 用于乳糖的原子类型和参数见补充表S2和S3（然而，乳糖参数不会影响QM定义的结果，因为它们会完全抵消，如下所述）。质量管理后精细化，散装固体校正和B类-因子精炼在中执行菲尼克斯.实空间差密度Z轴-计算所选结构的得分（RSZD）EDSTATS公司模块（Tickle，2012)的中央对手方清算所4个软件套件（Winn等。, 2011).

半乳糖凝集素-3的质量管理体系（图1)由乳糖配体、Arg144、His158、Arg162、Glu165、Asn174、Trp181、Glu 184和Arg186的侧链以及七个水分子（文中命名为Wat-1、Wat-2、Wat-3、Wat-4、Wat-5、Wat-6和Wat-7；见表1沉积构造中的相应数量）；总共153个原子。QM系统被选为包括所有与乳糖配体形成氢键的蛋白质残基和水分子，以及一个残基（Glu-165）和几个通过氢键连接这些残基的水分子。通过将CG、CB、CB、CA和CB原子分别替换为H原子（氢链接原子方法），在QM系统中截断Arg、His、Glu、Asn和Trp侧链，如在ComQum-U公司软件（Ryde，1996; Ryde&Olsson，2001年).

图1 质量管理系统（图3中的S1)用于ComQum-U公司半乳糖凝集素-3的计算。QM计算中涉及的所有原子都显示为棒状，而蛋白质的其余部分显示为卡通，其余的水分子被隐藏。乳糖显示为黄色C原子，而蛋白质残留物显示为灰色C原子。

2.2。LPMO公司

X射线结构系数、坐标、占用率和B类因子是从AA10 LPMO（Bacik等。, 2017; PDB条目5vg0型). 中子结构因子从PDB入口获得5vg1型，同一AA10 LPMO（Bacik）的2.1º分辨率结构等。, 2017). 质量管理之前精细化，经典X射线-中子接头精炼使用执行菲尼克斯定义，从X射线结构的坐标开始，用菲尼克斯.就绪集手动添加N末端原子的.D原子。经典接缝的全部细节精炼可以在Caldararu找到等。(2018). 相同的质量管理精炼然后按照galectin-3的描述进行操作，但X射线数据没有被截断(即所有达到1.1°分辨率的数据都保存在重新定义中）。然而，各向异性B类因子被丢弃为加拿大国家统计局无法处理这些。

LPMO的质量管理系统（图2)由任一亚基中铜离子的第一配位球组成A类或B类酶的活性。它含有铜离子、His109的咪唑环、Phe164的苯环、完整的His32残基、O₂-衍生配体结合到铜原子和结晶水分子（Wat-301亚基A类亚单位中的Wat-307B类). 如上所述，通过将CB原子或C原子（对于His32）替换为H原子来截断QM系统中的三个残基。基于交替氧化状态的研究（Caldararu等。, 2018)，铜离子被认为是Cu²⁺，而氧物种被认为是过氧化物，O²²⁻，导致系统上的总净费用为0。

图2 QM系统（图3中的S1)用于ComQum-U公司LPMO的计算。

2.3. QM计算

QM计算使用涡轮发动机7.0（家具等。, 2014). TPSS（道等。, 2003)密度泛函理论（DFT）方法和def2-SV（P）基集（Schäfer等。, 1992)使用了。分散效应包括在经验DFT-D3方法中（Grimme等。, 2010). 该方法为生物化学和生物无机系统提供了合理的几何结构（Neese，2006; Sure&Grimme，2015年; 安东尼等。, 2015)并已在我们集团的许多应用中使用（Ryde，2016).

3.1. 实施

晶体学QM计算的附加值结构测定是为了使模型与晶体学数据和QM能量函数一致，避免不太准确的MM势，从而提供一个化学上更合理的模型。QM是针对QM/MM方法中结构的一个小但有趣的部分引入的。因此，我们仅在结构确定过程的最后步骤中引入QM计算，通常是在标准结构之后精细化。这不会从根本上影响整体结构，但会提供更好的局部几何形状，有助于解决密度图的模糊解释，并支持关于异常几何形状的结论。

我们决定实施QM和中子晶体学相结合的方法精炼在中加拿大国家统计局软件（Adams等。, 2009)有几个原因。首先，加拿大国家统计局是免费提供的软件，提供中子、联合中子和X射线的实现精细化。其次，我们以前的量化定义方法是在中枢神经系统软件（Brünger等。, 1998)这使得中子晶体学的扩展变得简单。第三，中枢神经系统最初是从查姆MM软件（Brooks等。, 2009)这意味着它由一种开放的符号语言组成，现有MM力场的实现，以及对能量和力的方便访问和操作，再次大大简化了实现。

晶体学的精炼原则上是使用形式的能量函数的全局伪能量最小化

哪里E类_2012年3月是整个模型的MM（或另一个经验或统计）能量函数（当整个系统分为两部分时，“12”下标的含义将在下面显而易见），而E类_X射线和E类_中子描述当前模型分别再现实验X射线和中子数据的紧密程度。原则上，后者可以是晶体学的R（右）因素，但通常更复杂最大似然 精炼使用目标函数（Pannu&Read，1996; 亚当斯等。, 1997). 两个权重因素w个_X（X）和w个_N个是需要的，因为E类_2012年3月通常以能量单位表示，而其他两个术语是普通数字。它们确定了三个（伪）能量项的相对权重，例如，设置w个_X（X）=0表示纯中子晶体学精炼执行。权重因子的理想值可以通过优化R（右）_自由的因子，但这对于联合能量函数来说是冗长的，因此通常确定它们，以便在简短的MD模拟中三个能量项具有相似的量级（Brünger&Rice，1997; 布伦格尔等。, 1989; 亚当斯等。, 1997).

QM计算可以通过简单替换引入该能量函数E类_2012年3月采用标准QM/MM能量函数（Ryde，2016). 在这里，QM被用于蛋白质中一个限制但有趣的部分，称为系统1或QM系统。MM用于所考虑模型中的剩余原子，称为系统2（因此整个系统将称为12，如E类_2012年3月). 在减法QM/MM方法中（Cao&Ryde，2018)，可通过以下方式获得：

在这里，E类_{质量管理1}是系统1的QM能量E类_MM1公司是同一系统的MM能量。后者通过在E类_2012年3月（因此，结果将不取决于质量管理系统使用的MM参数）。w个_毫米是一个比例因子，因为基于统计的力场中枢神经系统（Engh&Huber，1991年)通常给出的能量大约是基于能量的力场（Ryde）的三倍等。2002年). 因此，w个_毫米始终设置为1/3。在具有基于能量的力场的标准QM/MM中，w个_毫米=1，因此通常省略（Ryde，2016).

更换E类_2012年3月在（1）中具有E类_{质量管理/市场营销}在（2）中给出了最终的综合能量函数：

通过使用解析微分法和氢链接原子的链式法则，从该能量函数中获得了力（Ryde，1996; Ryde&Olsson，2001年).

的流程图ComQum-U公司程序如图3所示。它是使用加拿大国家统计局 xn_最小化.inp和xn_bindividial.ip文件，通过一些简单的修改写出晶体能量和力。这可确保执行所有正常的晶体学操作和计算，例如体积-固体修正和R（右）因素。此外，有必要以比标准PDB文件更高的精度读取和写出坐标，以避免收敛问题（Ryde等。2002年). 为了计算晶体能量和力，将最小化步骤的数量设置为零，而在松弛步骤中，将其设置为一。这个最大似然 精炼采用振幅靶。一个简单的中枢神经系统脚本还用于计算E类_MM1公司能量项。整个量子重定义过程由一个Linux shell脚本驱动，该脚本基于涡轮摩尔几何优化脚本失业救济金（弗切等。, 2014). 质量管理体系的放松由放松中的程序涡轮发动机，采用Broyden–Fletcher–Goldfarb–Shanno拟牛顿方法。继续进行几何优化，直到两次迭代之间的能量变化小于2.6 J mol⁻¹(10^–6任意单位），笛卡尔梯度的最大范数低于10^–3任意单位。有关该程序的进一步说明，请访问网址：https://signe.teokem.lu.se/~ulf/Methods/comqum_u.html，并且该接口可以根据请求由作者提供（但请注意加拿大国家统计局和涡轮发动机需要单独安装，并且涡轮发动机是必需的）。galectin-3测试系统的典型重新定义需要大约150个QM能量和梯度计算，在单个处理器上需要大约5小时，而较小的LPMO测试系统的重新定义只需要大约90个QM的能量和梯度，在单个处理机上需要大约2小时。

图3 的流程图ComQum-U公司程序。S1和S2表示系统1和2。粗体的步骤构成实际ComQum-U公司接口。斜体的步骤由晶体学执行精炼程序(加拿大国家统计局)，而带下划线的是由QM程序运行的。整个过程由Linux shell脚本驱动。

标准晶体学精炼在没有任何静电MM项的情况下执行。对于X射线数据来说，这是自然的，因为H原子的位置通常是未知的，并且氢键的静电性强烈地取决于氢的位置。对于中子结构，大多数（但通常不是所有）H（D）原子的位置是已知的，但精炼传统上仍然是在没有任何静电的情况下进行的。使结果与标准获得的数据兼容精细化，我们决定在计算中排除静电。然而，应该注意的是，静电可以很容易地包含在能量函数中，使用MM原子电荷E类_2012年3月和蛋白质的点电荷模型E类_{质量管理1}静电的影响将在未来的研究中进行评估。最后，应该注意的是，质量管理计算自然涉及静电，需要包括质量管理系统中所有H原子的位置。

3.2. 半乳糖凝集素-3的性能

The performance of theComQum-U公司通过重新定义与半乳糖素-3的全氘化碳水化合物再认识域结合的乳糖的初步、未发表的1.7μ分辨率中子结构，对程序进行了检查。该结构最初是根据来自同一晶体的X射线和中子数据，使用菲尼克斯定义（阿富宁等。, 2012)并被简短地重新定义为加拿大国家统计局（亚当斯等。, 2009)运行量程之前精细化。我们在QM系统中包括乳糖配体、八个附近的氨基酸侧链和七个水分子，如图1所示（共153个原子）。

我们首先通过使用不同的权重因子值优化结构来检查程序是否正常工作w个_X（X）和w个_N个在（1）-（3）中从0到10。通过设置w个_X（X）=w个_N个=0，我们基本上获得了活动站点的QM/MM结构，尽管中枢神经系统MM力场，无任何静电。从晶体学角度来看，这给出了一个相当差的结构R（右）系数（0.25/0.23、0.21/0.19；这四个值是R（右）_自由的/R（右）首先是中子数据，然后是X射线数据）。

接下来，我们使用8×8个不同的权重因子值进行细化w个_X（X）和w个_N个（0、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3和10）。产生的结果R（右）值如图4所示和补充表S1。可以看出，最好的R（右）获得的中子数据值（0.214）是最大的w个_N个=10，正如预期的那样。当w个_X（X）增加了。同样，最好的R（右）X射线数据值（0.179）为最大值w个_X（X）= 10. 然而R（右）_自由的对于中子和X射线数据（分别为0.233和0.207），在大约w个_N个=1和w个_X（X）=3。这表明精炼函数工作正常，通过优化这两个权重因子可以获得最佳值R（右）_自由的值，尽管曲面相当平坦。执行额外的散装固体校正和B类-因子精炼在里面菲尼克斯减少了R（右）_自由的X射线数据值为0.179，中子数据值为0.215（表2)，与从菲尼克斯定义独自一人。

图4 对R（右）权重因子的因子w个N个和w个X（X）在中精炼半乳糖凝集素-3（见方程式3): (一)R（右）N个自由的, (b条)R（右）N个, (c（c）)R（右）X（X）自由的和(d日)R（右）X（X）原始数据见补充表S1。

在图5中，我们比较了在没有QM的情况下优化的结构，以及与具有最佳权重的QM的结构w个_N个=1和w个_X（X）=3。可以看出，D原子的运动最大，尤其是水分子的运动，而重原子通常保持在相同的位置。

图5 初步半乳糖凝集素-3结构在（绿色）和（黄色中的C原子）QM精炼之前和之后的结构w个N个=1和w个X（X）=3。为了清晰起见，蛋白质残留物被隐藏起来（它们基本上不移动）。

例如，观察到弱结合水分子5的最大变化之一，它在原始结构中显示出非常不寻常的氢键，一个D原子指向Trp181的侧链DB原子（2.26º），另一个D分子指向溶剂（图6一). 在QM定义的结构中，该水分子旋转90°，因此氘核指向乳糖的O6原子（2.39º）和Glu184的OE原子之一（2.39á）。在这两种情况下，水分子还从乳糖的DO6′原子（分别为2.11和2.27？）获得氢键。

图6 四个水分子和一个蛋白质残基在半乳糖凝集素3:Wat-5初步中子结构的QM精炼中的显著运动(一)，Wat-6(b条)，Wat-7(c（c）)，Wat-4(d日)和Arg144(e（电子）). 原子在QM之前显示为绿色，在QM之后显示为红色/白色精细化。核武器2米|F类o个| − D类|F类c（c）|密度以1.0的淡蓝色显示σ深蓝色0.7σ（对于有序性较差的水分子Wat-5和Wat-6）。

Wat-6也是弱结合的，并且在D原子的位置上显示出大的变化（图6b条). 在原始结构中，它不形成任何氢键。相反，其中一个氘核距离Trp181的DE1只有2.48μ，这似乎是一种不利的相互作用。在QM定义的结构中，Wat-6旋转，从而为乳糖的O6′提供氢键。在这两种情况下，它也从乳糖的DO2原子获得氢键，但这种相互作用在QM定义的结构中也得到了显著改善，D–O距离为1.80º，而不是2.06º。

Wat-7也显示了一个相当大的重组（图6c（c）). 在原始结构中，一个D原子指向另一个水分子的D原子（Wat-2，1.69º）。在QM定义的结构中，D原子反而指向乳糖（但没有形成任何特定的氢键），因此O原子可以从Wat-2获得强氢键（D–O距离为1.72º）。

最后，Wat-4还经历了氢键网络的重组（图6d日). 在原始结构中，一个D原子指向溶液。然而，在QM重新定义的结构中，它反而与Glu-165的OE2原子形成了强氢键（1.84Ω）。在这两种情况下，另一个D原子与乳糖的O2′形成氢键，尽管它在QM/MM结构中缩短了0.1º（从1.99º缩短到1.86º）。因此，它桥接了Glu-165和配体之间的相互作用。

在配体中，DO1′原子表现出最大的运动，DO1’-O1′-C1′-C2′二面角发生了～100°的变化（图5). 这可能是为了缓解DO1′和DO2′（2.05℃）之间的短暂接触。然而，无论是在原始结构还是在QM定义的结构中，DO1′都没有与周围环境形成任何氢键（它暴露在溶剂中，但附近没有可见的水分子）。DO2′的运动可以忽略不计。

配体和蛋白质中的其他原子在相同的局部极小值内只表现出较小的调整，通常是为了改善氢键相互作用。例如，乳糖中的DO4移动0.70º，将His158到NE2的氢键距离从2.16º缩短到1.68º（图5). 蛋白质原子的最大运动是Arg144的DH12，其运动将与水分子（Wat-1）的氢键从1.77°提高到1.62°，如图6所示(e（电子）). 平均而言，QM系统中的蛋白质原子仅移动0.06–0.17 Au，Arg144的移动量最大。

如果我们将最佳的QM定义结构与纯QM/MM结构进行比较，则使用w个_N个=w个_X（X）=0，观察到更大的运动，如图7所示事实上，QM系统中原子的中位数运动为0.5º，而QM定义结构的中位数移动为0.1º。对于大多数残基，这表示氨基酸侧链的方向发生轻微变化（旋转或倾斜）。然而，一些水分子移动了1.8º，一些乳糖原子也显著移动（O1′和DO1′移动了1.7º）。当然，这种较大的运动反映了乳糖和水不像氨基酸侧链那样受周围结构的约束，氨基酸侧链由主链原子保持在适当的位置（在优化过程中保持不变）。然而，从图中可以看出，水分子远离电子和中子密度，这说明了联合QM的优点精细化。QM/MM和实验数据之间的差异是由于后者包括动力学和熵，以及周围溶剂的平均效应，但晶体中也存在无序现象。

图7 乳糖和水分子在QM/MM结构中的位置(w个X（X）=w个N个=0，绿色）或对晶体学数据有限制(w个N个= 1,w个X（X）= 3). 第2个米|F类o个| −D类|F类c（c）|1.0时的电子密度σ显示为蓝色网格和核2米|F类o个| −D类|F类c（c）|密度为1.0σ显示为紫色表面。

接下来，我们研究了与半乳糖凝集素3（PDB入口）结合的乳糖的沉积中子结构6个月)，其中子数据的完整性更高，之前在年进行了联合精炼菲尼克斯1.12条。与初步结构相比，沉积结构在乳糖分子周围含有较少的水分子（图8). 有趣的是，四个水分子中的三个（Wat-5、Wat-6和Wat-7）在量子之后表现出了大规模重组精炼在更保守的解释沉积结构中不存在，这表明这些水分子在原始结构中没有很好的有序性。这些水域的核密度差异可以在PDB入口中看到6个月在低轮廓水平。此外，沉积结构中的Wat-4处于量子力学建议的方向精炼第一个结构，证明QM精炼初步结构中发现了水分子的正确方向。

图8 沉积的galectin-3结构的覆盖层（PDB入口6个月，蓝色；曼佐尼等。, 2018)以及QM之前（绿色）和之后（黄色）的初步结构精细化。为了清楚起见，蛋白质残留物被隐藏起来。

我们还表演了量子精炼沉积结构，仅包括QM系统中的五个水分子：Wat-1、Wat-2、Wat-3、Wat-4和Wat-8（见表1对于沉积结构中的相应水量，PDB条目6个月). Wat-8在初步结构中不存在，它与Wat-3形成氢键，并位于Trp181附近。乳糖分子还显示了两个D原子DO4和DO2′的不同取向。引人注目的是，在沉积结构中，DO4原子接近于量子中的位置精炼初步结构。没有蛋白质残基在两个结构之间显示出任何显著的重新定向。

联合质量管理精炼使用之前QM中的优化重量精细化， w个_N个=1和w个_X（X）=3，给出R（右）_自由的中子数据为0.211，X射线数据为0.156B类-因子精炼在里面菲尼克斯). 然而，有了这些重量，几个原子在量子之后就会脱离核密度精细化，例如Wat-1、Wat-2和配体DO2原子（图9一). 因此，我们从两个相对权重开始执行了两组权重搜索：w个_X（X）/w个_N个=3，这是初步结构中使用的重量，以及w个_X（X）/w个_N个=1，如Manzoni所用等。(2018). 我们使用线性搜索w个_N个=w个_X（X）=1至w个_N个=w个_X（X）=10且从w个_N个=1和w个_X（X）=3至w个_N个=10和w个_X（X）分别为30。为了比较结果结构的质量，我们从中子图中计算了乳糖和水分子的最大绝对RSZD值，该中子图测量了模型的局部精度，对局部差异敏感。如表3所示，从QM获得的结构精炼具有w个_N个=w个_X（X）=7最符合晶体学数据，Wat-1和乳糖分子的RSZD比使用较低重量的QM精制低一个单位以上。然而，可以使用其他重量来获得类似质量的结构，例如使用w个_N个=w个_X（X）=6或w个_N个=5和w个_X（X）=15导致量子系统中残基的RSZD值相似。这个R（右）_自由的与从质量管理中获得的值相比，结果结构的值没有变化精炼具有w个_N个=1和w个_X（X）=3（0.213和0.159；表2). 对于两个权重值较高的情况，RSZD分数的改善较小，对于权重大于10的情况，QM计算中出现了收敛问题。

图9 QM细化之前（蓝色）和之后沉积的半乳糖凝集素-3结构的叠加(一)w个X（X）=3和w个N个=1（洋红中的C原子）和(b条)w个X（X）=w个N个=7（C原子为橙色）。核武器2米|F类o个| −D类|F类c（c）|密度为0.8σ以蓝色显示。为了清楚起见，蛋白质残留物被隐藏起来。

图9(b条)显示了原始沉积结构和QM定义结构之间的比较w个_N个=w个_X（X）=7（使用w个_N个=5和w个_X（X）= 15). 如质量管理中所述精炼在初步结构中，虽然在较小程度上观察到D原子的最大运动，因为中子数据的质量高于初步结构。水分子仍然改变方向以形成更有利的氢键，这表明QM精炼也可以提高结构的质量。

Wat-2观察到一个这样的运动。质量管理精炼使其O原子定向，与Arg-144形成氢键（图10一)，如质量管理中所述精炼初步结构。引入QM系统（Wat-8）的新水分子也会轻微旋转，使一个D原子指向溶液。

图10 水分子Wat2的运动(一)乳糖分子中DO4原子的(b条)为了在QM后形成更有利的氢键精炼沉积构造的w个X（X）=w个N个= 7. 核武器2米|F类o个| −D类|F类c（c）|密度为1.0σ以蓝色显示。

在配体中，几个D原子显示出微小的调整，以形成更有利的氢键：DO3到Wat-3、DO4到His158和DO3′到Glu184。质量管理精炼对于DO4原子的构象特别重要，因为核密度不允许明确指定其位置（图10b条). DO2表现出最大的运动，但它没有形成氢键，因为在初步结构（Wat-6）中氢键结合的水分子在沉积结构中不存在。蛋白质原子的位置没有显示出任何显著的变化，就像第一次QM精炼一样。

检查质量管理精炼没有恶化蛋白质结构，验证统计数据用摩尔概率对于最终结构(w个_N个=1和w个_X（X）=3，对于初步结构和w个_N个=w个_X（X）=沉积结构的7）。如表2所示，结构显示出与QM之前相同的质量精细化，然而R（右）/R（右）_自由的与R（右）/R（右）_自由的从中执行的标准重新定义中获得的值加拿大国家统计局.

最后，我们通过将坐标随机修改0.1Å（使用phenix.pdb工具)在质量管理体系中重新实施质量管理精细化。这导致了相同的最佳结构（质量管理体系的均方根误差为0.05º）。因此，本文中报告的水运动超出了结果的统计不确定性。

3.3. 裂解多糖单加氧酶（LPMO）的应用

量子的主要用途精炼适用于标准化学约束可能较差的系统（例如金属部位或非标准配体或抑制剂）或标准精炼给出了模棱两可的结果。为了说明这种典型的应用，我们还对一种含铜化合物的中子结构进行了测试金属酶，LPMO公司。在最近的一项研究中，Bacik及其同事建议在亚单位中B类酶的末端N原子（与铜原子配位）部分脱质子（Bacik等。, 2017). 这得到了N端原子周围不对称核差密度峰的支持。然而，解释相当含糊，因为该模型仅针对2.1º分辨率的中子数据进行了改进，并且没有在结构中明确建模N末端氘。因此，为了区分质子化或去质子化N末端是否更符合数据，我们进行了联合QM精炼根据X射线和中子数据。这是合适的，因为X射线晶体和中子晶体的空间群和单位-细胞参数几乎相同。

为了确定最佳权重，我们对沉积的半乳糖凝集素结构进行了类似的线性搜索。我们保留了相对权重因子w个_X（X）/w个_N个=1（这是中的默认值菲尼克斯定义)并从w个_X（X）=1至w个_X（X）=10。然后，我们比较了量子系统中残留物的RSZD分数（包括铜原子和过氧化物分子）。所有计算均在亚单位上进行A类，因为这表明N末端的质子化没有歧义。如表4所示不同的权重并没有改变结构对数据的拟合程度，不同权重的所有RSZD得分几乎相同。这并不完全令人惊讶，因为QM系统非常严格，数据质量比galectin结构差。然而，如果重量进一步降低(w个_N个=w个_X（X）=0.1或更小）RSZD显著增加，表明结构过于偏向QM。

因此，我们选择了w个_N个=w个_X（X）=1（RSZD得分最低，不会使结构偏向QM或晶体学数据），并执行QM精炼带有亚单位B类在量子系统中。我们比较了使用两种不同模型的结果，一种是N末端质子化(即建模为–ND₂)另一个去质子(即建模为–ND^——). 图11在脱质子化模型（图11中央的绿色网格）中，靠近N端的正差异密度清晰显示b条)表明将N末端建模为质子化-ND₂该组是联合中子和X射线数据的更好解释。对这些计算及其对酶生物功能的影响的更深入的讨论已在别处发表（Caldararu等。, 2018).

图11 亚单位LPMO活性位点的结构和核密度图B类质量管理后精细化。(一)质子化-ND中的N末端2形式和(b条)去质子化ND中的N末端——形式。2米|F类o个| − D类|F类c（c）|1.0时的核密度σ显示为蓝色网格米|F类o个| −D类|F类c（c）|核差异密度显示为3.0σ（绿色网格）和−3.0σ（红色网格）。

这个细化统计最终QM定义的结构如表5所示至于半乳糖凝集素结构，蛋白质的整体结构保持其完整性R（右）/R（右）_自由的与使用北卡罗来纳州立大学在QM细化之前。