1.简介

在蛋白质晶体的X射线衍射中，尖锐的布拉格峰伴随着扩散散射：峰之间和峰下的条纹、云状特征和其他图案。散射来自晶体中的缺陷，例如不同的蛋白质构象。与仅对平均电荷密度敏感的布拉格衍射不同，漫反射散射对电荷密度变化的空间相关性敏感。因此，漫反射散射为蛋白质构象集成建模提供了独特的数据。

长期以来，人们一直对使用漫散射来验证蛋白质晶体（Clarage）的分子动力学（MD）模拟感兴趣等人。, 1995; 福雷等人。, 1994; 赫里等人。, 1998; Meinhold&Smith，2005年一,b条, 2007; 墙壁等人。, 2014). 计算方面的最新进展现在使漫射散射（Wall）的微秒持续时间模拟成为可能等人。, 2014)和布拉格衍射（Janowski等人。, 2013, 2016)可以克服使用10ns或更短的MD轨迹所看到的限制（Clarage等人。, 1995; Meinhold&Smith，2005年b条). 在微秒内模拟单个葡萄球菌核酸酶单位电池（墙等人。, 2014)MD模拟和漫反射数据之间的一致性很大程度上是由于各向同性成分，这是一种所有蛋白质晶体都可见的小角度散射样图案。由于溶剂和蛋白质的贡献大致相等，因此与该成分的一致性很重要（Meinhold&Smith，2005一; 墙壁等人。, 2014). 各向异性分量约弱10倍，与模拟结果的一致性较差（线性相关性为0.35–0.43）。各向同性和各向异性成分之间的精确度差距必须缩小，因为各向异性成分结构丰富，几乎完全来自蛋白质，这为验证蛋白质运动的详细模型创造了可能性。各向异性分量的准确建模是释放漫散射和MD模拟的潜力以建模构象系综的关键。

墙壁等人。(2014)注意到单个单位电池可能会限制漫散射MD模型的准确性，并建议用多个单元模拟较大的晶体截面可能会提高准确性。在这里，通过构建一个2×2×2的周期模型来验证这个想法超级电池葡萄球菌核酸酶并进行5.1µs持续时间的MD模拟。根据该模拟计算的扩散强度各向异性分量与数据的线性相关为0.68，表明超级电池仿真大大提高了模型的准确性。分析使用Patterson方法这表明相关性的距离依赖性得到了很好的捕捉。模拟得出的平均结构因子与晶体结构；然而，存在局部偏差，这表明了改进MD模型的途径。这个B类模拟得出的因素与晶体结构并改进了TLS模型。与单元间仿真类似超级电池包含数据的模型在一微秒内达到最大值。这表明，散射计算所需的模拟持续时间可能与系统大小无关，因为它的增加超过了相关性的长度尺度。最后，刚体运动只解释了动力学的一小部分，表明在蛋白质晶体的MD模拟中，内部运动可能比堆积动力学更重要。

2.方法

2.1. 分子动力学模拟

使用PDB条目创建溶剂化结晶模型1个数控（Loll&Lattman，1989年). 在剥离水之后，UCSF奇美拉(https://www.cgl.ucsf.edu/chimera网站/)用于添加晶体结构。使用上下文晶体结构作为指导，N末端的六个缺失残基被建模为β-链和C末端的8个缺失残基被建模为α-螺旋线。A类P（P）1单位电池蛋白质和胸腺嘧啶核苷3′，5′-二磷酸（pdTp）配体被构建在UCSF奇美拉使用空间组 P（P）4₁（每个单元格四份）。单位-细胞参数为一=b条= 48.499,c（c）= 63.430 Å,α = β = γ = 90°. 系统扩展到2×2×2超级电池在96.998×96.998 x 126.860°右矩形盒中，使用道具PDB从琥珀色工具(https://ambermd.org)（图1).

图1 葡萄球菌核酸酶超细胞模型。包含四个蛋白质分子的八个单位细胞以2×2×2的布局排列。蛋白质链被渲染为卡通。pdTP配体呈红色。水原子用斑点状的蓝色球体表示。图像是使用渲染的PyMOL公司(网址：https://pymol.org/).

分子动力学模拟使用GROMACS公司（贝伦德森等人。, 1995)v.5.0.2（设置和第一个4.1µs）和v.5.1.4（扩展到5.1µs）。蛋白质拓扑结构的定义使用gmx公司带CHARMM27参数（MacKerell等人。, 1998, 2004). His-protonation声明来自格罗姆普未经修改就使用了。15 440 TIP3P水分子添加使用gmx溶剂化物为了中和该系统，192水被Cl取代⁻离子使用gmx基因使用瑞士Param服务器(网址：https://www.swissparam.ch/; 佐特等人。, 2011).

使用恒定NVT系综进行模拟。晶体模拟需要NVT模拟，以便能够将任何计算的密度和结构因子与晶体结构同时避免了仿真过程中单元间参数漂移带来的困难。之后的模型gmx基因模拟时显示出较大的负压通过NVT中。不能使用使用NPT模拟初步平衡压力的溶剂化系统的标准方法，因为这会改变箱体尺寸，因此单位单元格。目前的方法是迭代执行能量最小化、添加谐波约束的NVT模拟和求解，直到获得接近100 kPa的压力。经过几次迭代，水分子的数量增加了1890个，达到17 138个。从轨迹的前110 ns计算出的平均压力为1.8 MPa，标准偏差为13 MPa，表明该过程是成功的。

最后一个系统由129462个原子组成。有32个蛋白拷贝，32个pdTp配体拷贝，32Ca²⁺离子、17 138水分子和192 Cl⁻反离子。

对于生产模拟，时间步长为2 fs，LINCS完整约束用于所有键，无谐波约束。每十步执行一次邻居搜索。粒子网格Ewald（PME）算法用于静电相互作用，截止值为1.4 nm。采用64×64的倒数网格和四阶B样条插值。范德瓦尔斯相互作用采用1.4nm的单一截止值。温度耦合与v重缩放算法。蛋白质-配体复合物被视为与其余原子分离的温度基团。使用了周期性边界条件。每2 ps获得一次轨迹快照GROMACS公司 .xtc文件格式。轨迹的前110 ns用于初始设置和平衡。然后，首次生产运行将持续时间延长至1.1µs。随后以1µs的增量将扩展到5.1µs（如上所述，最后一微秒使用的是更高版本的GROMACS公司). 平衡轨迹的大小为27GB，其余各为245GB。根据周期的可用性，在LANL Institutional Computing机器上完成每微秒的模拟大约需要2-4周。

3.结果

使用溶剂化的超级电池由8个单位细胞组成的2×2×2布局的结晶葡萄球菌核酸酶模型（图1, §2). 模拟总持续时间为5.1µs。每2 ps采样一次，获得以下片段的轨迹：初始平衡（0–110 ns）、110–1100、1100–2100、2100–3100、3100–4100和4100–5100 ns。

根据100 ns截面的轨迹计算漫射强度，并使用各向异性分量评估与数据的一致性（§2). 在平衡后的100 ns内，模拟与数据之间的线性相关为0.62。后续截面至1100 ns的相关性范围在0.59和0.62之间（图2，框）。超过1100毫微秒后，与数据的一致性有所下降：1100到5100毫微秒之间100毫微秒截面的相关性在0.56到0.60之间。

图2 对于MD轨迹的连续100ns截面（虚线框）和作为运行平均值（实线）评估的模拟和实验漫射强度之间的线性相关性。运行平均值在第一微秒内达到最大值0.68。

扩散强度的运行平均值（从连续100 ns截面计算的平均扩散强度）与数据的相关性从0.62稳步增加到0.68，从110 ns增加到700 ns；它保持在0.68到1100毫微秒之间，然后缓慢下降到0.67毫微秒（图2，实线）。110-1100毫微秒范围内的平均值用作后续分析和可视化的模拟扩散强度。

模拟和实验得出的衍射图像看起来类似（图3). 除最低分辨率外，模拟中的云层特征形状与实验数据完全相符。这些功能的优势有一些很大的差异；例如，模拟图像下半部的大而强烈的红色特征（图3，左侧面板）比实验衍生图像中的相应特征弱（图3，右侧面板）。

图3 通过模拟（左侧面板）和实验（右侧面板）三维漫反射强度计算的模拟衍射图像的比较。晶体取向对应于旋转序列中的第一个衍射图像。显示屏被截断为1.6°。在可视化之前，减去每个散射矢量的平均像素值，然后减去图像中的最小值。图像是使用彩虹彩色地图显示的Adxv公司（阿瓦伊，2012)，任意选择像素值范围以突出相似性。

在宽分辨率范围内，模拟和数据之间的相关性非常显著（图4，实心台阶），与图3中漫反射特征相似的范围一致。在高于10º分辨率的32个分辨率壳中，相关性至少为0.52，除三个外，其他所有壳的相关性均高于0.6。在3Å分辨率以下，模拟和数据之间的一致性远远小于对称和非对称数据集之间的一致性，这表明在该分辨率范围内对数据建模还有改进的空间。在2°分辨率以上，数据和模拟之间的一致性高于遵守对称性的程度，这表明对称平均可能消除了数据中的一些系统误差。低于10º分辨率时，协议变得非常小（低分辨率异常值除外），CC_{sym（对称）}数值也变得非常小，这表明在波束停止附近没有准确测量数据。

图4 模拟和数据（实线）之间的分辨率依赖性一致性与数据的自我一致性相比较，如使用预期P（P）4个/米对称（虚线）。

的实际空间比较Patterson函数电荷密度变化（§2） 表明仿真和数据都显示出与距离相似的调制（图5). 变化幅度在x个=0截面（图5一和5b条). 在z（z）=0段，模拟的振幅变化比长距离数据的振幅变化更大（图5d日和5e（电子）)，表明该平面内的相关性在模拟中比在数据中更强。根据模拟计算的Pattersons与数据之间的线性相关性为0.70。Patterson根据Bragg数据计算得出（图5c（c）和5（f）)在长距离上显示出更高的振幅特征，表明平均值的相关性长度尺度比电荷密度变化的相关性长度范围要长。

图5 将模拟漫射强度的傅里叶变换（左面板）与实验数据（中面板）和布拉格数据（右面板）进行比较。只有各向异性分量用于计算变换。正轮廓为黑色，负轮廓为红色。轮廓为0.5σ介于0和10之间σ在漫反射数据中，并调整为与σ/我最大值在其他面板中。(一)x个=0截面，模拟；(b条)x个=0截面，漫反射数据；(c（c）)x个=0截面，布拉格数据；(d日)z（z）=0截面，模拟；(e（电子）)z（z）=0截面，漫反射数据；(（f）)z（z）=0截面，布拉格数据。这些图是使用地图切片器在里面中央对手方清算所4（优胜者等人。, 2011).

这个RSCC公司使用晶体结构以及模拟计算出的布拉格反射振幅（§2） 在大多数地区都很高（图6，紫色线）；然而，N末端的残基6-8和残基46-52有特别大的下降（<0.6）。平均值RSCC公司所有残留量为0.80。的地区晶体结构用高B类因素（图6，蓝线）包括N末端和之前观察到的无序环晶体结构残留物44–50（Loll&Lattman，1989). 模拟平均结构（§2） 和晶体结构为0.7º，高偏差集中在蛋白质的局部区域（图6，黄线）。残渣丝复合物B类因素来自晶体结构模拟平均结构非常相似（图7); 两者之间的线性相关为0.94。通过比较，残渣-丝状复合物B类TLS模型中的因子晶体结构低估了N端和柔性环中的无序（图7); 之间的线性相关性B类来自个体ADP的因子与TLS模型为0.89。

图6 模拟结构因子和晶体结构之间的残差比较。利用晶体结构和模拟布拉格反射计算了实际空间相关系数（紫色线）。各向同性B类因子（蓝线）取自晶体结构。重原子原子坐标（黄线）的r.m.s.d.在模拟的平均结构和晶体结构之间进行计算。

图7 残留物的对比B类因素来自晶体结构（紫色）、MD模拟平均结构（青色）和TLS模型晶体结构（绿色）。

4.讨论

与扩散数据的各向异性分量的0.68相关性远高于先前使用MD模拟实现的相关性。当前模拟使用了超级电池模型，而之前的模拟使用的是晶体蛋白的单位-细胞模型。此外，与之前的模拟相比，本模拟包括N和C端的理论模拟残差。为了确定包括额外残基在实现增加的相关性中的作用，对单个单位电池使用扩展模型执行（未发布的工作）。第一微秒内模拟和实验扩散强度之间的相关性为0.42，而之前的相关性为0.35–0.43（Wall等人。, 2014). 使用超级电池因此，该模型可以解释漫散射模拟精度的提高。

一种可能的解释是超级电池模型简单地说是与单元模型相比，集合的大小增加了。细胞内原子对的数量是2×2×2的八倍单位电池而不是单位-细胞轨迹的等效持续时间。然而，与每100 ns段数据的一致性超级电池模拟（相关性在0.59–0.62范围内）远高于单位-细胞模拟的第一微秒协议（相关性为0.42），对于单位-细胞的模拟，集合稍大。改进超级电池因此，该模型不能归因于更大的系综。改进的另一个可能的解释是互易空间使用超级电池模型。这个超级电池该模型每产生两个预测米勒指数沿着三个方向，或扩散强度的八倍以上预测。将这些预测与类似采样的漫反射数据集进行比较，包括半整数的测量米勒指数，其中布拉格峰值信号最小。相比之下，单位-细胞模型只能以整数进行预测米勒指数，其中数据中布拉格峰值信号的抑制更具挑战性。为了验证这一解释，漫反射强度由超级电池模型使用P（P）1单位电池(§2） ，生成以整数采样的网格米勒指数。使用与评估单元间仿真相同的数据集评估了该计算的准确性。微秒内的累积相关性为0.66，与P（P）1超晶胞计算和更精细的采样数据集。因此，这种改善不能用漫反射信号的精细采样来解释。

对改进的最合理解释超级电池该模型更真实地描述了动力学，尤其是跨单位细胞边界的相互作用。这种解释与正常模式分析研究一致，其中包括晶体接触（昆都等人。, 2002; 里卡尔迪等人。, 2009)并使用Born–von Kármán边界条件（Riccardi等人。, 2009, 2010)改进了晶体数据的拟合。改进MD的一个基本原理是，使用较低精度的单元-细胞模型可以通过周期性边界条件人为地增加远程原子之间的位移相关性，因为原子可以成为模拟框边界的邻居。此伪影对整数采样的漫反射强度值的影响米勒指数应使用2×2×2周期超级电池，因为没有两个原子在一起单位电池可以是模拟框的邻居。因为模拟框相对边缘附近的原子仍然可以位于超级电池然而，模型甚至更大超级电池模型可能会进一步提高模拟的准确性。更大的超细胞也可以产生大规模运动的详细模型，这些模型已经使用蛋白质扩散散射的简单模型进行了研究，例如核糖体晶体中的声晶体振动（Polikanov&Moore，2015）)，溶菌酶晶体中的耦合刚体运动（Doucet和Benoit，1987)以及溶菌酶（Clarage）晶体中具有长相关长度的液相运动等人。, 1992)和钙调蛋白（Wall、Clarage等人。, 1997).

正如在超晶胞模拟，残差B类单单元单元模拟的平均结构系数与晶体结构（补充图S1一); 两者之间的线性相关为0.95，而超晶胞模拟。与晶体学的类似高度一致B类在3×2×2超级电池晶体的P（P）1只鸡蛋白溶菌酶（Janowski等人。, 2016). 这个RSCC公司在晶体结构单元间仿真也类似于超级电池模拟（补充图S1b条); 平均值RSCC公司单元-细胞模拟的所有残差为0.82，而超级电池模拟。与单元间模拟相比超级电池因此，仿真特别改进了结构变化模型，而不是平均结构模型。

与数据的最大一致性是在模拟的前1100 ns内实现的。达到最大值所需的时间与之前发布的单元间模拟（Wall等人。, 2014). 由于扩散强度仅对变化中的两点相关性敏感，因此该结果表明，与实验数据最为一致的运动是在比单位单元格。从布拉格数据和漫反射数据计算出的Patterson之间的比较支持相关性的短尺度，这表明漫反射Patterson在长距离上衰减（图5). 在这项研究之前，人们的期望是超级电池模拟需要比单元间模拟更长的持续时间，因为更大的系统需要更长的长度尺度上的运动，而长度尺度通常较慢。值得注意的是，MD模型的准确性还有很大的改进空间，要实现与数据的更高相关性，可能需要更长的模拟持续时间，对收敛到热力学系综的要求更严格。漫射散射计算所需的相对持续时间超级电池 与对于不同的蛋白质晶体，单元-细胞模拟也可能不同。然而，这个例子表明，对于足够大的超细胞，准确的漫反射散射计算所需的模拟持续时间可能与系统大小无关。

根据模拟和实验散射强度计算的Patterson图之间有很大的相似性（图5). 扩散Patterson的整体调制在模拟和数据之间尤其相似，这表明MD模拟很好地捕捉到了相关性的距离依赖性。Patterson沿一和b条然而，格向量在数据中比在模拟中更为明显，这表明模拟中的关联长度尺度比在z（z）=0平面（图5c（c）和5d日).

如果模拟完美地描述了实验系统，那么根据数据的测量精度，预计一致性会在很长一段时间内增加或趋于平稳。然而，超过1100毫微秒的一致性有所下降，表明模拟偏离了数据。虽然减少可能是暂时的，并且长时间运行当前模拟最终会导致协议增加，但最简单的解释是MD模型长期偏离实验行为。

残渣中的浸渍RSCC公司图（图6，紫色线）表示模拟电荷密度局部偏离晶体结构。N端和残基46–52处的凹陷对应于高B类-因子区域（图6，蓝线），可能反映了使用B类因素（加西亚等人。, 1997). 在RSCC公司也对应于模拟平均结构和晶体结构（图6，黄线）。这些不仅包括高B类-要素区域，但也有许多低要素区域B类因素。低谷B类-具有高r.m.s.d.s的因子区域表示模拟的原子位置局部偏离晶体结构。这些地区的差异将是改进MD模型的特别好的目标。

改进MD模型有许多具体途径。使用更多的上下文可以更准确地模拟N和C末端的缺失残基晶体结构。2×2×2超级电池可以扩展到更大超级单元格。母液中发现的其他化合物可以添加到模型中(例如23%2-甲基-2,4-戊二醇）和离子强度可以更准确地模拟溶剂；目前的模型只包括水和中和反离子。MD力场可能存在不准确之处；重要的是，MD模型的精度现在应该足够高，以便能够使用晶体学数据改进力场，就像使用核磁共振数据进行验证一样（查特菲尔德等人。, 1998)导致MD力场的改善（Lindorff-Larsen等人。, 2010, 2012; Showalter&Brüschweiler，2007年). 时间平均组合精炼生成的模型更接近晶体结构（伯恩利等人。, 2012)并可与漫反射数据结合使用，以生成更准确的构象系综。可能还需要更高质量的数据来大幅改进模型。

最近的固态核磁共振（ssNMR）实验与晶体蛋白模拟相结合（Kurauskas等人。, 2017; 妈妈等人。, 2015; 莫利卡等人。, 2012)利用结晶学和核磁共振为MD模拟的联合验证创造机会。蛋白质GB1（Mollica）的ssNMR+MD研究等人。, 2012)显示了200 ns MD模拟与纵向弛豫速率和化学位移数据之间的合理一致性，而横向弛豫率的一致性较低。泛素（Kurauskas）的ssNMR+MD研究等人。, 2017; 妈妈等人。, 2015)将横向弛豫率归因于晶格，从模拟中提取的振幅为3-5°。为了评估刚性体旋转在当前葡萄球菌核酸酶模拟中的重要性，将32份蛋白质的快照与参考结构（§2). 欧拉角的标准偏差大多在1–2°范围内，单个值低至0.8°，高达2.3°（图8一). 对齐后，快照和参考结构之间的坐标r.m.s.d.降低，但对于大多数蛋白质副本，仅降低10–20%，最小值为8%，最大值为28%（图8b条). 因此，刚体旋转不是当前仿真中动力学的重要组成部分。

图8 根据整个蛋白质的刚体运动分析MD轨迹。(一)欧拉角的标准偏差，使蛋白质快照与参考结构最佳对齐。(b条)将蛋白质快照与参考结构对齐前后计算的坐标的R.m.s.d.s。

进一步研究适合蛋白质编号4和31的旋转矩阵，其中ψ-角度标准偏差分别为2.3和2.2°，揭示了旋转分析中的一个陷阱。目视检查这些蛋白质数量的轨迹，发现第一微秒内围绕残基42–54的柔性环发生构象变化（图9). 当环的尖端被移除时（残留物46–52；使用图9中的木棍渲染)，的ψ-这些蛋白质数的角度标准偏差减少了0.7°。这意味着旋转矩阵拟合并不像通常假设的那样仅报告刚体运动；因此，在使用刚体运动模型解释MD模拟时需要谨慎。对晶体泛素MD轨迹（Kurauskas等人。, 2017; 妈妈等人。, 2015)看看旋转配合的变化是否与假设的刚体旋转相对应，或者它们是否可能反映内部运动。

图9 蛋白质31在110纳秒（绿色）和1001纳秒（粉红色）下的快照。旋转拟合中忽略的N端（左）和C端（右上）的七个残基为白色。欧拉角的SDψ当取下柔性环的尖端（残余物46–52，用木棍指示）时，旋转配合的减少0.7°。图像是使用渲染的PyMOL公司(网址：https://pymol.org/).

的建模B类与TLS模型相比，使用MD模型改进了因子（图7). 这与TLS模型可能低估蛋白质最活跃区域的紊乱的预期一致（反过来B类因素本身可能低估了潜在的疾病；加西亚等人。, 1997). 总的来说，这里的分析强调了内部运动的重要性，并建议独立刚体平移的作用较小（Ayyer等人。, 2016)或旋转（Pérez等人。, 1996)在蛋白质扩散散射中。确定刚体运动对其他蛋白质，尤其是比葡萄球菌核酸酶更硬的蛋白质是否重要将是重要的。将晶体学、ssNMR和MD模拟相结合，以开发具有多个验证点的晶体蛋白质动力学精确模型的研究，强烈希望揭示蛋白质晶体中真正发生的变化机制。

在布拉格分析中，良好的分子置换溶液与布拉格数据的线性相关约为0.80。单个原子位置和B类然后可以细化因子以确定晶体结构这是晶体实验特有的。因为每个布拉格反射都是由晶体结构，只有在对整个结构进行足够精确的建模后，局部原子细节才能得到解决。类似地，当整个构象系综以足够的精度建模时，漫反射数据的精确模型可能只会揭示分子运动的原子细节。

目前的相关性为0.68，虽然这是一个显著的进步，但可能只反映了模型与数据的全球一致性，而不是对模拟细节的验证。对于布拉格数据，一旦模型与各向异性扩散数据的相关性足够高，扩散散射的优点数字，如相关系数或R（右）这些因素可能成为MD运动是否真实的更敏感指标。如果能够实现这一点，那么晶体学和MD模拟将成为一个强大的工具，用于获得晶体蛋白质中生物分子机制的实验验证模型。