Smaller capillaries improve the small-angle X-ray scattering signal and sample consumption for biomacromolecular solutions

Schroer, M.A.; Blanchet, C.E.; Gruzinov, A.Y.; Gräwert, M.A.; Brennich, M.E.; Hajizadeh, N.R.; Jeffries, C.M.; Svergun, D.I.

doi:10.1107/S1600577518007907

研究论文

的日志
同步加速器
辐射

国际标准编号：1600-5775

第25卷| 第4部分| 2018年7月| 第1113-1122页

https://doi.org/10.1107/S1605575518007907

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较小的毛细血管改善了生物大分子溶液的小角度X射线散射信号和样品消耗

马丁·施罗德,^一 ^* 克莱门特·布兰切特,^一 Andrey Yu。格鲁济诺夫,^一梅利莎·A·格拉沃特,^一玛莎·布伦尼奇,^b条内利·R·哈吉扎德,^一 Cy M.杰弗里斯 ^一和德米特里·斯维尔贡 ^一

^一欧洲分子生物学实验室（EMBL），汉堡分站c/o DESY，Notkestrasse 85，22607 Hamburg，Germany和^b条欧洲分子生物学实验室（EMBL），格勒诺布尔分站，71 Avenue des Martyrs，38042 Grenoble，France
^*通信电子邮件：martin.schorer@embl-hamburg.de

巴西圣保罗大学A.F.Craievich编辑(2017年10月6日收到； 2018年5月28日接受； 2018年6月26日在线)

现代同步加速器设施中强X射线束的辐射损伤是溶液中大分子生物小角度X射线散射（SAXS）研究的主要并发症之一。为了限制损坏，样品通常在层流下通过试管（通常是毛细管）进行测量，以便在测量过程中新鲜溶液持续暴露在光束中。可以计算出在给定X射线波长下优化散射吸收比的毛细管直径先验的基于基本物理特性。然而，这些成熟的散射和吸收原理并没有考虑到样品的辐射敏感性，也没有考虑到用于实验的珍贵生物材料的数量通常非常有限。这里显示，对于生物溶液SAXS，直径小于根据简单散射/吸收标准计算得出的直径的毛细血管可以更好地利用辐射敏感样品的可用体积。通过比较两种毛细管直径可以证明这一点d日_我(d日_我=1.7 mm，接近10 keV的最佳值；和d日_我=0.9 mm，名义上为次优），用于研究不同流速下的不同蛋白质溶液。使用较小的毛细血管最终可以从有限数量的纯化生物大分子中收集高质量的SAXS数据。

关键词：小角度X射线散射;蛋白质溶液;辐射损伤;流经示例环境.

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1.简介

小角度X射线散射（SAXS）用于探测溶液中生物大分子的结构（Graewert&Svergun，2013 ; 斯科等。2014年一 ; 斯维尔根和科赫，2003年 ; 斯维尔贡等。, 2013 ; Schroer&Svergun，2018年 ). 最先进的研究是在同步加速器SAXS束线进行的，部分或全部致力于结构生物学（Blanchet等。, 2015 ; 佩尔纳等。, 2013 ; David&Pérez，2009年 ; 井上等。, 2013 ; Acerbo公司等。, 2015 ; 克拉森等。, 2013 ; 柯比等。, 2013 ; 锂等。, 2016 ). SAXS关于生物大分子溶液的数据收集提出了具体的实验挑战。溶质通常很稀（按体积计超过99%的水），X射线对比度低，因此减去溶剂散射后散射强度很弱。Synchrotron SAXS利用了光辉提高X射线源的信号强度；然而，高光辉也有缺点。由于样品处于水溶液中，X射线束从溶剂中光解产生的自由基和溶剂化电子可能会导致辐射损伤和形成大分子聚集体，从而使SAXS曲线无法解释（加里森，1987 ; 马列克尼亚等。, 2001 ; 库瓦莫托等。, 2004 ). 由于辐射损伤的可观察效应不仅取决于样品上沉积的剂量，而且在很大程度上取决于溶质聚集的趋势，因此不可能在测量之前充分预测预期效应的大小。更复杂的是，样品本身可能只有有限的数量。因此，需要在潜在辐射损伤和样品消耗的影响之间平衡SAXS数据收集，以最大限度地提高数据质量，即优化未受损样品记录的弱散射强度中的信噪比。减轻辐射损伤的影响对于生物SAXS（bioSAXS）测量尤其重要（布鲁克斯·巴特利特等。, 2017 ; 霍普金斯和索恩出版社，2016年 ; 杰弗里斯等。, 2015 )并且，为了减少这种影响，可以采用几种方案。这些包括连续的样品流、光束衰减、添加小的“清除剂”分子或低温冷却（菲舍蒂等。, 2003 ; 杰弗里斯等。, 2015, 2016 ; 柯比等。, 2016 ; Kuwamoto公司等。, 2004; 梅斯伯格等。, 2013 ，萨赫勒等。, 2015 ). 在下文中，我们表明，还可以优化样品暴露单元的几何结构，以限制辐射损伤的影响，并改善辐射敏感样品的SAXS测量轮廓。

SAXS强度的大小，我，从稀释的蛋白质溶液中测量可以描述为

$[I\left（s\right）\，\propto\，c\，I（0）\，P\left$

哪里秒是与X射线波长相关的波矢动量传递λ以及散射角2θ作为秒=4π罪θ/λ.给，c（c）表示溶质浓度，我（0）前向散射， P（P）(秒)归一化形状因子[即 P（P）(0) = 1],t吨曝光时间，A类_X光样品位置的X射线束面积，d日样本路径长度和μ(E类)总数线性衰减系数。直观地说，减少X射线束中的时间会减少我(秒); 然而，将样品作为一组连续的短曝光而不是一个长曝光进行测量，有助于检测辐射损伤的开始，并确保仅平均从未受光束诱导变化影响的样品中收集的数据，从而提高数据准确性。总数线性衰减系数取决于给定X射线光子能量下的X射线吸收和散射截面E类.方程式（1）表示给定采样路径长度时固定浓度下的最强散射信号d日_选择= 1/μ（参见§S1，图S1支持信息)通常在解决方案SAXS测量中满足。在实践中，使用直径在1到2mm之间的圆柱形玻璃毛细管，因为这些毛细管与d日_选择=1.0 mm（在E类=8千伏）和d日_选择=1.9毫米（在E类=10 keV），这是稀释水性高分子样品的合理近似值。

计算散射信号最大化的最佳路径长度时，只考虑了随机X射线与样品的相互作用，如下所述μ(E类)没有考虑辐射损伤的影响。后者可能导致形成不同的溶质状态，在本研究中主要是聚集体，这些都产生不同的形状因子P（P）(秒). 它来自P（P）(秒)结构信息是可以获得的，最终，一个成功的bioSAXS实验需要最大化我(秒)没有引起X射线引起的变化P（P）(秒)在X射线照射期间。

由于大分子样品的束内寿命有限，并且通常数量有限，因此有必要优化SAXS信号，该信号可以作为样品体积的函数进行采集，同时将辐射损伤降至最低。圆柱形毛细管的直径影响强度我(秒)吸收，因此定义了样品体积的使用效率。许多SAXS波束线的波束面积在范围内A类_X光=100–500µm×100–500¦Μm，因此，如果将大量样品放置在1–2 mm毛细管内，则完全不会暴露在外，并且会从未测量的毛细管中流出。直径较小的毛细管增加了照明体积与非照明体积的比例，从而提高了样品的利用率。此外，对于连续流动实验，较小的毛细管可以使较高的流速更快地刷新通过光束的样品，从而减少辐射损伤的累积效应。因此，尽管小直径毛细血管基于方程式（1）中描述的第一原理散射强度越低，路径长度的减少可能会被更有效的数据收集方案所抵消，以最终从未损坏的样品中获得更高质量的散射数据。在这项工作中，我们进行了比较研究，证明直径小于计算出的最佳厚度的毛细血管确实对从辐射敏感生物样品中测量的SAXS剖面提供了整体改进。

2.实验细节

2.1. 样品制备

粉末状超纯鸡蛋清溶菌酶购自Affymetrix USB。牛血清白蛋白（BSA；冻干粉，结晶，>98%）购自Sigma。在所有情况下，蛋白质样品都是在室温下新鲜制备的(T型≃20°C），刚好在SAXS测量之前。将各蛋白粉的单个等分样品分别溶解在50 ml的40 m溶液中米千赫₂人事军官₄，60米米KCl，pH 6.8[选择这种磷酸盐缓冲液是为了增加这两种蛋白质对辐射损伤的敏感性（Jeffries等。, 2016)]. 将溶质过滤0.22µm，以产生最终蛋白质浓度为c（c）=4.4毫克毫升⁻¹和c（c）=2.9毫克毫升⁻¹分别是。使用NanoDrop分光光度计通过UV吸收来评估最终浓度。这个A类_280纳米吸收系数表示为E类_0.1%（=1毫克毫升⁻¹)根据每个蛋白质的一级氨基酸序列使用ProtParam公司（Gasteiger公司等。, 2005 ：英国标准协会E类_0.1%= 0.614; 溶菌酶E类_0.1%= 2.653). 用于制备蛋白质样品的相同磷酸盐缓冲液也用作匹配的溶剂空白，以减少背景散射。

2.2。SAXS数据收集

SAXS测量在德国汉堡EMBL/PETRA III的EMBL P12 bioSAXS光束线进行（Blanchet等。, 2015; 哈吉扎德等。, 2018 )，使用X射线光子能量E类=10千伏(λ=0.124 nm），光束尺寸为200µm×350µm（V×H，半高宽，FWHM）通量属于F类= 5 × 10¹² 光子⁻¹在样品位置。使用机器人P12样本变换器（Blanchet等。, 2015; 圆形等。, 2015 )无论是否有连续的毛细管内样品流通过光束线（真空下水平定向）。在蛋白质溶液之前和之后，测量相应的缓冲溶液。在每次测量之间，对毛细管进行广泛清洁，以去除由于辐射引起的聚集体而产生的任何沉积物。

使用了两种不同直径的石英玻璃毛细管：（1）外径为d日_o个 =1.8 mm和内径d日_我 =1.7 mm，接近最佳路径长度(d日_选择=1.9 mm），用于10 keV X射线，以及（2）带有d日_o个=1.00 mm和d日_我=0.91 mm。两种毛细血管均购自德国希尔根堡。在下文中，它们将被称为d日_我=1.7毫米和d日_我分别=0.9 mm毛细血管。对于所有测量，恒定的样品体积为V（V）_总数=20µl加载到保持恒定温度的毛细管中T型=10°C。

SAXS数据是使用PILATUS 2M光子计数检测器（瑞士DECTRIS）从样品和缓冲液中记录的，使用完全相同的条件，在几种不同的流速和溶液的总暴露时间下，如结果对于所有实验，在X射线曝光过程中，每50 ms曝光时间（45 ms采集时间+5 ms探测器读出时间），将二维（2D）SAXS数据记录为一组连续图像（帧）。

2.3. SAXS数据分析

探测器上的2D图像用于估计每个样本中蛋白质散射的光子数量。首先，考虑到入射X射线强度的微小变化，将样品和相应缓冲液的散射模式缩放为储存环电流。然后将从缓冲液中收集的数据从相应样品的数据中减去，以获得溶液中蛋白质的减去2D图像。对于每个减去的2D图像，像素在0.12 nm范围内计数的光子数⁻¹<秒<2.9纳米⁻¹求和以获得积分散射光子计数。进行求和，直到框架显示出辐射损伤，产生积分光子数，我_整数样品中未受损的大分子。

为了评估辐射损伤开始的时间点，并获得用于后续分析的一维还原散射剖面，使用P12光束线SASFLOW管道（Franke等。, 2012 ). 简言之，2D SAXS图案被归一化为透射光束并进行方位平均。然后使用相关图法对所得SAXS曲线进行分析(CorMap（CorMap）; 法兰克等。, 2015 )由此，对顺序采集图像的一维（1D）轮廓进行成对比较，以确定整个图像的统计相似性秒-范围（相对于第一个数据帧）。仅高于相似性重要性阈值的帧α≥0.01用于生成给定样本和缓冲液的（帧）平均SAXS轮廓。对平均蛋白质SAXS数据进行校正，以获得在完全相同的条件下测量的平均缓冲区/背景散射，从而从蛋白质中产生SAXS信号，〈我(秒)〉，无辐射损伤。在所研究的纯缓冲溶液中，使用以下方法评估的单个数据帧中未观察到辐射损伤CorMap（CorMap）.

除了CorMap（CorMap）对每个数据帧进行两两评估，从样本中测量的所有单个图像都进行了数据缩减和缓冲区减法，使用平均缓冲区数据生成一组单个SAXS曲线我(秒)从中可以看出回转半径对_克使用吉尼尔近似值对跨框架进行评估[我(秒) $[\propto]$ 我（0）经验(-对_克² 秒²/3)，其中我（0）表示外推前向散射零角度（吉尼尔，1939 )].

While期间CorMap（CorMap）评估整个数据范围内数据帧之间强度的系统（相关）+1或−1方差（协方差）对_克根据吉尼尔近似值进行的评估仅使用从数据的线性拟合计算的极低角度的强度[当表示为ln时我(秒)与秒²，到对_克秒^最大值= 1.3]. 线性拟合，从中对_克根据Guinier图（与负斜率成比例）受信噪比和相关数据误差的影响。因此对_克误差估计可能相对较大，尤其是在使用单个数据帧时。在比较数据帧时对_克该方法没有考虑线性拟合期间可能出现的系统差异（线性相关系数不足以检测此类差异）。因此，联合使用CorMap（CorMap）和吉尼亚对_克提供了对损伤开始的可靠估计。CorMap（CorMap）还有一个优点是评估对比强度之间的系统差异是否发生在吉尼亚地区以外（涵盖损伤影响以更高角度显现的情况），即以较短的长度刻度）。

由于平均未受辐射损伤影响的单个SAXS曲线的主要目的是减少数据中的噪声，因此评估改变毛细管直径对产生的噪声水平的影响至关重要。因此我(秒)使用该程序进一步处理了〉曲线自动命名来自ATSAS公司程序包（Petoukhov等。, 2012 ; 法兰克等。, 2017 )以获得平滑的倒数空间拟合实验未损坏数据，我_AG公司(秒)（根据计算出的可能实际空间距离分布）。在所有情况下，相互空间配合CorMap（CorMap） 第页-数值大于0.01，表明计算拟合与实验数据之间没有系统偏差（Franke等。, 2015). 归一化偏差Δ〈我(秒)实验SAXS曲线的我(秒)〉，来自平滑AUTOGNOM公司 我_AG公司(秒)计算每个样本的函数，以便

$[\Delta\langle I\left（s\right）\langle=\left[\langle I\left（s\right）\langle-{我}_{\rm{AG}}\左（s\右）\右]/I_{\rm{AG}{\左（0\右）。\等式（2）]$

根据该归一化差异曲线，标量DEV确定为

$[{\rm{DEV}}={{1}\over{n_{{s}}}\sum\limits_s\big|\Delta\left\langleI\left（s\right）\right\rangle\big|，\eqno（3）]$

即归一化偏差模的总和除以实验数据点的数量n个_秒对于噪声数据，预计平滑曲线的波动我_AG公司(秒)将很高，产生较大的DEV，而较低的DEV值表示相对噪音水平较低。对于每个蛋白质物种，其各自的相同秒-范围和类似数量的数据点n个_秒用于计算DEV值。

为了确定SAXS曲线中用于确定建模结构信息的质量和信息含量，使用ATSAS公司程序沙努姆（Konarev&Svergun，2015年 ). 通过这种方法，可以可靠地检测到香农信道的数量米_S公司因此，在有用数据范围内的最大动量传递秒_选择测定了两种毛细血管。

3.结果

3.1. 样本几何形状和有效样本暴露量

图1(一)显示了从摄像机拍摄的图像，用于在线可视化内径的两个圆柱形样品毛细管d日_我=1.7毫米和d日_我=0.9 mm，在自动样品装载期间放置在抽空样品暴露装置中。视频显微镜检测样品的半月板，并将其放置在X射线束完全照射到溶液中，然后在固定位置或启用样品流的情况下测量溶液。在连续流动操作中，流速会自动调整，以使样品的全部体积在总曝光时间内通过入射X射线束。数据被采集为一组单独的图像，在曝光时间内通常为20×50 ms。在图1中(一)样品从左向右水平流动，X射线束与毛细管成90°，从图像底部向顶部穿过样品，水平束尺寸与流动方向平行，垂直束尺寸超出图像平面。光束对准毛细管中心，使通过样品的路径长度最大化。

图1
(一)放在样品转换器中的两种水平毛细血管的放大图像，装有溶液（侧视图），溶液可以固定在光束中（用于静态SAXS测量），也可以在X射线照射期间从左向右流动。(b条)不同几何形状中可访问样本体积的方案。这里，黑色方块标记X射线束的位置和大小，并表示焦距V（V）_梁暴露在光束中的样品；红色矩形表示V（V）_样品; 橙色矩形表示暴露的总体积V（V）_经验当使样品流动时；总装载量V（V）_总数以蓝色显示。箭头指示X射线束传播的方向。两个毛细血管都在(b条)总样本量相同V（V）_总数.

我们应区分毛细管内的以下体积：填充毛细管所需的样品体积，V（V）_样品，近似值为水平方向梁的尺寸乘以毛细管的横截面积；的体积V（V）_样品实际暴露在X射线束中，V（V）_梁对应于水平和垂直方向的光束尺寸乘以毛细管直径；流动样品时暴露的样品体积V（V）_经验.图1(b条)示意性地显示了几何图形。可以看出，在给定时间暴露的体积明显小于V（V）_样品。消耗的相应卷，但不对于固定样品测量，ΔV（V）_{损失，修复}=V（V）_样品−V（V）_梁，对于流动样品ΔV（V）_{损失，流量}=V（V）_总数−V（V）_经验.两者之间的比率V（V）_梁和V（V）_样品（以及V（V）_经验和总样本量V（V）_总数)反映了样本消耗效率。表1显示了的相应值d日_我=1.7毫米和d日_我=0.9 mm毛细血管，在流动条件下，减小内径的效果立即明显。事实上，减小毛细管直径后，总样品中暴露在X射线束下的比例要高得多。

表1
两种毛细管所用样品体积的比较

所有值都是针对总体积计算的V（V）_总数=20微升。d日_我：毛细管内径；V（V）_样品：完全暴露时填充毛细管所需的体积；V（V）_梁：光束的焦体积，即.固定样品的暴露体积；V（V）_经验：流动样品的暴露体积；ΔV（V）_{损失，修复}：固定样品未暴露于梁的加载体积；ΔV（V）_{损失，流量}：流动样品未暴露于梁的加载体积；V（V）_梁/V（V）_样品：消耗效率。

d日_我（毫米）	V（V）_样品（荷兰）	V（V）_梁（荷兰）	V（V）_经验（微升）	ΔV（V）_{损失，修复}（荷兰）	ΔV（V）_{损失，流量}（微升）	V（V）_梁/V（V）_样品(%)
1.7	794	178	4.47	617	15.53	22
0.9	223	93	8.33	130	11.67	42

对于固定位置的测量，与较小的毛细管相比，较大的毛细管需要大约3.5倍的填充体积，但实际上只有1.9倍的体积暴露在光束中，从而产生SAXS信号。当流动的总溶液体积为V（V）_总计=20µl，对于d日_我=0.9 mm毛细管，暴露体积甚至约为1.9倍d日_我=1.7 mm。这导致消耗效率为42%(d日_我=0.9 mm），与22%相比(d日_我=1.7毫米）。

3.2. 无样品流动的数据采集

除了总样品消耗量外，综合散射强度我_整数这两种毛细血管中的蛋白质溶液与成功的SAXS测量密切相关。对于背景校正的2D数据，单位时间的平均积分散射强度t吨每1mg ml⁻¹样品数量，我_整数/(总胆固醇)，已测定溶菌酶和BSA蛋白样品（图2一). 通过分割各个传输，对石英玻璃毛细血管的吸收进行校正T型.

图2
(一)每次积分散射强度t吨每1mg ml⁻¹溶菌酶和BSA浓度c（c）在两个毛细血管中。数据经石英毛细血管壁吸收校正。(b条)每次和每个样品体积的强度，V（V）_样品，需要填充毛细管，这比光束的焦体积大得多（见表1

). 固定蛋白溶液的回转半径作为暴露时间的函数(c（c）)溶菌酶和(d日)英国标准协会。十字标记接受的单个SAXS曲线的数量CorMap（CorMap）（蓝色：d日_我=1.7毫米；红色：d日_我=0.9毫米；黑色：用于两者）。

对于d日_我=1.7mm，固定位置的散射强度高于d日_我=0.9 mm。因此，正如理论上所预期的那样，减小毛细管直径会导致单位时间内的积分散射减小。另一方面，每次的散射强度和装载的每体积样品，V（V）_样品，对于较小的毛细管更好（图2b条). 因此，如果能够测量足够数量的无辐射损伤SAXS曲线，则较高的样品消耗效率和较低的散射强度仍然可以产生总体上改进的散射强度统计数据。

辐射损伤的开始可以通过观察回转半径对_克随着时间的推移。图2(c（c）)和2(d日)显示回转半径多次重复的平均值作为曝光时间的函数t吨分别用于溶菌酶和BSA在两个毛细管中的固定样品。固定位置的溶菌酶样品（图2c（c）),对_克之后已增加t吨=45 ms，与毛细管直径无关。对于较长的曝光时间CorMap（CorMap）分析没有发现任何统计相似性（黑十字）。在这种情况下，无法从数据中获得可靠信息，因为第一条SAXS曲线中已经存在辐射损伤。对于辐射敏感性稍低的牛血清白蛋白，发现了类似的结果（图2d日).

总之，对于固定样品，辐射损伤的开始与毛细管直径无关，而与每次的总散射强度有关和每体积样品，V（V）_样品，对于较小的毛细管，则较高。因此d日_我=0.9 mm毛细管允许进行更多的重复测量，从而可以获得更大的总散射强度。重复实验的一种自然方式是使用毛细管内的样品流，这将在下一节中讨论。

3.3. 流动样品数据采集

3.3.1. 流速

使用固定的总样品体积，研究了毛细管尺寸对连续流动通过X射线束的样品测得的SAXS强度的影响V（V）_总数对于各种样品输送体积流量问（来自问=10微升秒⁻¹到问=40微升秒⁻¹). 相应的线性样品流速v（v）= $[Q/[\pi（d_{\rm{i}}/2）^2]$ ，明显高于d日_我=0.9 mm毛细管，与d日_我=1.7 mm毛细管，如果样品以相同的流速输送，则平均停留时间更短t吨_{驻留，驻留}=w个/v（v）宽X射线束中的蛋白质溶液w个（在这种情况下，为350µm），因此平均辐射剂量较低（参见支持信息).

毛细管中液体的流动特性通常由雷诺数Re表征=ρ虚拟数据_我/η（罗特，1990年 )，其中ρ表示流体密度和η这个动态粘度。对于此处描述的溶液样品（由99.5%的水质量组成）和给定的毛细管直径，最高雷诺数为Re=43(T型=10°C）。该值远低于Re≃2000（Rott，1990）的临界值)层流破裂所需，因此假设对于稀释蛋白质样品，层流状态保持不变。

对总样品体积进行了流量测量V（V）_总数=20微升。通过改变短路总次数，可以获得通过X射线束的不同流量(t吨_经验=50 ms）连续测量的SAXS暴露，N个_SAXS，这样的话

$[N_｛\rm｛SAXS｝｝＝｛｛V_｛\rm｛tot｝｝｝\超过｛Q\，t_｛\rm｛exp｝｝｝｝｝。\eqno（4）]$

（注：t吨_经验=50 ms是采集时间的总和t吨_科勒=每曲线45 ms，读取时间为t吨_阅读=Pilatus 2M探测器的5 ms。）总曝光时间，t吨_总数样品的，即X射线束中每个样品的最大照度（不考虑辐射损伤）由下式给出t吨_总数=t吨_经验N个_SAXS公司表2中总结了实验参数对应于使用相同总体积在两个毛细管中以不同流速采集的两个蛋白质样品的SAXS数据。

表2
两种毛细管的实验参数比较

问：总体积流量；v（v）：线性流速；t吨_{驻留，驻留}：X射线束中的平均停留时间；Re：雷诺数（对于水）；N个_SAXS公司：采集的SAXS曲线数量；t吨_总计：样品的总暴露时间。由于直径较小d日_我=0.9 mm毛细管，等效流速的流速更高，平均停留时间更短。

	v（v）（毫米秒⁻¹)		t吨_{驻留，驻留}（毫秒）		重新
问（微升秒⁻¹)	1.7毫米	0.9毫米	1.7毫米	0.9毫米	1.7毫米	0.9毫米	N个_SAXS公司	t吨_总数（毫秒）
0	0	0	1000	1000	0	0	20	1000
10	4.4	15.7	45	13	6	11	40	2000
20	8.8	31.4	23	6	11	22	20	1000
40	17.6	62.9	11	三	23	43	10	500

蛋白质溶液的层流可以用简单的抛物线径向速度剖面来描述（Rogers，1992 ). 在毛细管壁处，流速接近零，预计辐射损伤会更强（Nielsen等。, 2012 ). 对于给定的线性流速v（v），两种毛细血管在不同流速下的速度分布表明，对于d日_我=0.9 mm毛细血管，因此蛋白质和聚集物沉积的概率较低（参见§S3，图S2）。

3.3.2. 毛细血管大小对辐射损伤发生的影响

图3显示了溶菌酶在流速下的一系列单1D-SAXS曲线问=20微升秒⁻¹对于d日_我=1.7毫米和d日_我=0.9 mm毛细血管。在这两种情况下，使用连续流收集了20个单个SAXS剖面。对于d日_我=1.7 mm，暴露于t吨=245 ms，如零角附近散射强度的系统性增加和极低值时负斜率的增加所观察到的秒(秒<0.5纳米⁻¹，图3一). 相比之下，对于d日_我=0.9 mm毛细血管，辐射损伤的开始时间显著延长，因此在以下情况下，数据中的聚集物形成不明显：t吨=495 ms（图3b条).

图3
单个SAXS曲线我(秒)与秒用于溶菌酶样品(一)d日_我=1.7毫米和(b条)d日_我总共=0.9 mm毛细血管体积流量问=20微升秒⁻¹.随着曝光时间的增加秒由于辐射诱导聚集物的形成而增加，尤其是在大直径毛细管中。

辐射损伤的开始更清楚地反映在回转半径对_克，和图4显示对_克作为曝光时间的函数t吨对于两个毛细管中不同的体积流量。在流动样品问=10µl秒⁻¹在一定程度上减少了表面对_克与固定样品相比，但仅略微减少辐射损伤（图4一). 对于d日_我=1.7 mm，之后t吨=90 ms，辐射损伤已经可以检测到，而对于d日_我=0.9毫米，数据最多可达t吨=200 ms可平均。似乎较小毛细管中的聚集物的尺寸和/或数量低于较大毛细管中的聚集体，这可能是因为前者的线流速较高，因此辐射剂量较低。增加对_克在t吨=800毫秒d日_我=0.9 mm可能是由于形成了与以下情况类似的较大骨料d日_我=1.7 mm，但在t吨=1000 ms，由于体积流量。这种效应可能类似于旋涡环流，它使样品溶液在毛细管中心和壁之间循环，正如之前报道的毛细管流（尼尔森等。, 2012).

图4
回转半径，对_克溶菌酶与暴露时间的关系t吨在两个毛细管的不同流速下：(一)的问=10微升秒⁻¹, (b条)问=20微升秒⁻¹, (c（c）)问=40微升秒⁻¹。十字标记接受的单个SAXS曲线的数量CorMap（CorMap）（蓝色：d日_我=1.7毫米；红色：d日_我=0.9毫米）。

正如预期的那样，当流速增加时，观察到的辐射损伤较小。然而，值得注意的是问=20微升秒⁻¹（图4b条)以及问=40微升秒⁻¹（图4c（c）)对于d日_我=0.9 mm毛细管d日_我=1.7 mm。此外，对于流动样品，对_克由于辐射损伤形成的聚集体达到了一个平台值，该值随着流速的增加而连续下降。BSA也得到了类似的结果（参见§S4，图S3），对于BSA，辐射损伤的总影响略低，而且溶液甚至部分暴露不足，即实际上，在辐射损伤开始之前，可以获取更多的SAXS剖面。

3.3.3. 毛细管尺寸和流速对积分散射的影响

当样品在连续流动下进行测量时，在限制辐射敏感蛋白质样品的辐射损伤率方面，直径较小的毛细管明显比较大的毛细管更有效。这源于较高的线性流动速度，v（v）以及通过毛细管补充样品的相关增加。因此，可以连续收集更多的单个SAXS数据帧，在帧平均后，可以提高生成的SAXS曲线中的信噪比。实际上，最终的积分散射我_整数从未损坏样品中采集的d日_我=0.9 mm毛细管，与d日_我=1.7 mm毛细管，即方程（1）预测的0.9mm系统散射强度的降低（如固定位置结果所述，§3.2)被更快的流量抵消，减少了辐射损伤，同时在总曝光时间内被照射的样品体积比例更高。

分析样品在辐射损伤开始之前暴露在X射线束下的时间（作为流速的函数）是有指导意义的，这也可以在SAXS测量期间轻松测试。图5(一)显示曝光时间，t吨_{av（平均值）}，其中溶菌酶样品可以在辐射损伤开始前根据流速进行测量问.增加t吨_{av（平均值）}随着流速的增加，更重要的是d日_我=0.9 mm，与之相比d日_我在辐射损伤开始之前观察到=1.7毫米。该图还显示了总暴露时间t吨_总数用于整个SAXS曲线集。在以下情况下d日_我=1.7 mm，所有研究流速均存在辐射损伤；对于d日_我=0.9毫米问=40微升秒⁻¹，几乎所有SAXS曲线都是相似的，可以求平均值。

图5
显示辐射损伤前的暴露时间，t吨_{av（平均值）}和积分散射强度我_整数，作为的函数体积流量问用于溶菌酶(一, b条)和BSA(c（c）, d日)两个毛细管中的溶液。总曝光时间t吨_总数还显示了每个测量值的。（数据和误差条来自重复测量。）

图5(b条)显示了SAXS模式在显示辐射损伤之前的综合散射强度，我_整数，确定溶菌酶是体积流量用于两个毛细血管。从问=10微升秒⁻¹至20µl s⁻¹，随着SAXS曲线出现辐射损伤的次数减少，完整样品的积分强度增加。在以下情况下d日_我=1.7毫米，我_整数在错误范围内相同问=20微升秒⁻¹和问=40微升秒⁻¹对于较小的毛细管，也观察到类似的结果。

就BSA而言，情况有所不同，因为蛋白质对辐射不太敏感（图5c（c）, 5d日)（杰弗里斯等。, 2015). 图5(d日)显示我_整数作为流量的函数。对于较大的毛细管，最佳流动条件我_整数位于问=20微升秒⁻¹而对于较低或较高的流速，天然BSA的散射强度较小，可记录。对于d日_我=0.9毫米，我_整数更大，用于问=10微升秒⁻¹和20µl s⁻¹比d日_我=1.7 mm。仅在问=40微升秒⁻¹是来自较大采样路径长度的信号越高。更有趣的是，最佳条件出现在问=10微升秒⁻¹可检测到最高信号的位置。

通过查看问依赖t吨_{av（平均值）}和t吨_总数（图5c（c）). 在最高流速的情况下，两个毛细管都不存在辐射损伤，所有曲线都可以取平均值，因此总SAXS强度对于d日_我=1.7 mm，因为更多的蛋白质产生信号（然而，以较低的样品消耗效率为代价，参见§3.1). 随着流速的降低，大型毛细管受到辐射损伤，从而达到最佳测量条件问=20微升秒⁻¹（最长曝光时间t吨_{av（平均值）}). 相比之下，对于d日_我=0.9 mm，在样品移动的所有研究条件下，几乎没有辐射损伤。因此，在这种情况下，样本是“曝光不足”的，因为在辐射损伤开始之前可能已经收集了更多的帧。

3.3.4. 毛细管尺寸对一维数据噪声级的影响

最终，结构生物SAXS实验的目标是从给定的样本量中收集最佳SAXS模式（尽可能低的噪声），下面详细讨论平均SAXS曲线的噪声水平。

图6(一)显示了帧平均SAXS曲线〈我(秒)〉用于在两个毛细管中获得的溶菌酶样品以及光滑的AUTOGNOM公司曲线问=20微升秒⁻¹。每帧的散射强度d日_我=1.7 mm毛细管高于d日_我=0.9 mm毛细管，如前所述（§3.2)但是，由于用于平均的帧数较多，噪声级发生了变化。平均曲线中的噪声（图6一和6b条)实验数据和平滑曲线之间的归一化差异更加明显，Δ〈我(秒)〉[见方程式（2），图6c（c）]. 可以看出，Δ〈我(秒)〉在零附近波动，而这些波动的幅度对于d日_我=1.7毫米。

图6
(一)帧平均SAXS曲线〈我(秒)〉用于d日_我=1.7毫米和d日_我总共=0.9 mm毛细血管体积流量问=20微升秒⁻¹.虚线表示相应的平滑线AUTOGNOM公司曲线。最大有用数据范围秒_选择用十字架标记。(b条)缩放(一)较小的秒较小毛细管的噪声级与较大毛细管相比有所改善。(c（c）)标准偏差自动命名曲线，Δ〈我(秒)〉，适用于两条曲线。(d日)参数DEV作为总量的函数体积流量问用于两个毛细血管。

为了量化差异，计算了所有〈的参数DEV我(秒)〉遵循方程式（3），结果如图6所示(d日).对于固定样品(问=0微升秒⁻¹)，DEV较高d日_我=0.9 mm，因为45 ms后两个毛细管中的辐射损伤都已可见，并且最佳路径长度可获得最高信号。如前所述，不能排除第一帧已经存在的辐射损伤，因此不进一步考虑这种情况。对于流动样品，DEV较小d日_我=0.9 mm，比d日_我=1.7 mm，表示相对噪声较低。达到以下最低值问=20微升秒⁻¹和40微升秒⁻¹，该速率也会产生类似的强总散射强度我_整数和时代t吨_{av（平均值）}无辐射损伤。

两种毛细管在不同流速下获得的有用数据范围和最佳香农通道数与毛细管直径没有明显关系。对于固定样本秒-范围限制为秒_选择<4.0纳米⁻¹和米_S公司= 8. 当蛋白质溶液流动时，可以使用较大角度的散射强度来确定结构信息(秒_选择<4.5纳米⁻¹和米_S公司= 10).

对于更稳定的BSA样品，其暴露不足d日_我=0.9 mm毛细管，基本结果相似（§S4，图S4）。在这里，两个毛细血管之间的差异并不像溶菌酶样品那样明显，因为它们具有相似的强积分散射强度。

4.结论

我们已经证明，对于高度辐射敏感的样品，如溶液中的生物大分子，在样品通过X射线束的连续流动下，使用路径长度小于理论计算的最佳值的圆柱形毛细管可以产生更有效的样品消耗和更高质量的SAXS数据。通过比较两种毛细管直径证明了这一效果(d日_我=1.7 mm，接近10 keV的最佳值；d日_我=0.9 mm，次优）。

根据样品消耗量、辐射损伤起始时间、综合散射强度和噪声水平，分析了不同设置下确定的SAXS曲线。基于这些参数，发现d日_我=0.9 mm的高辐射敏感样品的SAXS曲线比d日_我=1.7 mm。对于较小的直径，样品消耗更有效，允许使用给定的样品体积进行更多重复。对于相同的体积流率，较小的毛细血管可以实现较高的流速，从而加快样品的补充，从而减少辐射损伤。无损伤的单个SAXS曲线数量越多，因此，整体较高的综合散射强度超过了次优路径长度的影响。根据这些结果，使用较小的毛细血管有利于标准批量模式测量，如在多个bioSAXS光束线上进行的测量。这些发现通过使用不同实验参数在不同SAXS光束线（BM29，ESRF）上进行的额外测量得到了证实（见§S5）。

与大分子晶体学不同，低温下的辐射损伤直接取决于样品上沉积的剂量，因此可以在测量之前考虑（Garman，2010 )在bioSAXS中，损伤强烈依赖于蛋白质形成聚集体的倾向，这一点不一定是已知的先验的也可以依赖于缓冲区。如图所示，优化数据收集将使SAXS数据能够安全获得，并减少辐射损伤。

通过比较不同流速下溶菌酶和牛血清白蛋白的数据，发现两种情况：（i）样品表现出明显的辐射损伤，因此严重过度暴露；（ii）样品没有显示出大的损坏并且暴露不足。最佳条件是收集尽可能多的没有辐射损伤的SAXS曲线。这方面的标准可以是比较暴露时间没有辐射损伤，t吨_{av（平均值）}和总暴露时间，t吨_总数，适用于不同的体积流量。鉴于d日_我=0.9 mm溶菌酶的最佳条件可能是流速略低于问=40微升秒⁻¹增加了SAXS曲线的数量，在BSA的情况下，流速甚至略低于问=10微升秒⁻¹可以延长使用寿命。数量t吨_{av（平均值）}和t吨_总数以及问在对给定样品进行SAXS测量期间，可以很容易地确定和更改，以获得最佳条件，从而提供最长的束内完整性。或者，样品可以高速飞行；交互式数据分析将显示样本是否损坏。如果不是这样，可以使用相同的样品重复测量，直到发现辐射损伤。这种方法基本上不限于线性流，也可以用于振荡流。

所给出的结果对于在溶液上进行bioSAXS测量的光束线具有特别的相关性，无论有无自动样本变换器。X射线束尺寸不断减小到微米级，以及更加明亮的X射线源的开发，刺激了微流控设备的使用，特别是在有限样品消耗的情况下研究蛋白质溶液的快速混合和剪切（Brennich等。, 2011 ; 格拉切法等。, 2013 ; 彭等。, 2017 ; 施韦默尔等。, 2016 ; 斯科等。2014年b条 ; 维兰德等。, 2016 ). 由于路径长度更小，可达几十微米，且壁材散射的背景贡献较大，因此优化的数据采集方案（如本文所建议的方案）非常重要。

流通环境的最佳设计高度不对称，厚度为d日_选择X射线束范围内的垂直尺寸，即几微米。然而，这种器件的可复制制造是一项非平凡的任务。此外，为了选择合适的材料，机械稳定性、真空能力、辐射鲁棒性以及大范围内的低背景信号秒-必须考虑范围。使用直径较小的标准圆柱形玻璃毛细管是其他小型化方法的简单替代方法。总的来说，使用较小的毛细管似乎是进行测量和获得无辐射损伤的高质量数据的最直接方法。

5.相关文献

支持信息中引用了本文正文中未引用的以下参考文献：Henke等。(1993 ).

支持信息

截面S1至S5；表S1至S2；图S1至S5。DOI（操作界面）：https://doi.org/10.107/S1600577518007907/co5096sup1.pdf

致谢

作者感谢Tomer Cohen在BM29测量期间提供的支持。

资金筹措信息

以下资金已获确认：联邦教育部fur Bildung und Forschung/röntgen-Angström集群项目“TT-SAS”（MAS第05K16YEA号赠款）；Deutsche Forschungsgemeinschaft（授予AYG的编号为GZ:SV 9/5-1）；EMBL跨学科博士后计划（EIPOD）和玛丽·居里COFUND（MAG奖）；地平线2020：iNEXT（批准号653706）。

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