2.1. 结晶数据收集、数据处理和分析

所有实验均在瑞士维利根PSI瑞士光源（SLS）的超指向磁光束线X06DA（PXIII）上进行，工作电压为2.4 GeV，自顶向下模式为400 mA。光束线有一个能量分辨率为1.4×10的双通道切Si（111）单色器⁻⁴以及90×50µm的椭圆光束（FWHM）。数据是在100K下收集的，波长为2.066Å（6keV）通量约1.5×10¹⁰ 光子⁻¹.在不同的χ和φ多轴PRIGo测角仪的设置（Waltersperger等。, 2015)在PILATUS 2M-F探测器上（亨利克等。, 2009)在无快门模式下以10或20 Hz的帧速率和120 mm的采样到检测器距离运行。数据处理使用XDS公司并与进行缩放和合并XSCALE公司（卡布施，2010年). 高分辨率数据截断基于统计指标CC_1/2和CC*（Karplus和Diederichs，2012年).下部结构使用SHELXC公司/D类/E类（Sheldrick，2010年)使用香港（HKL）2地图接口（Pape&Schneider，2004). 异常峰高的计算方法如下阳极没有决议截止（Thorn&Sheldrick，2011). 使用找到的正确站点数SHELXD公司使用进行评估SITCOM公司（Dall’Antonia&Schneider，2006年).精炼和模型图互相关计算使用菲尼克斯（亚当斯等。, 2010). X射线剂量用放射性剂量-3D类（泽尔丁等。, 2013). 使用以下公式估算Bijvoet比率

哪里（f）〃是硫的虚散射贡献（6 keV时为0.95 e），N个_一个是的数字反常散射原子，N个_P（P）是指非对称单元，和Z_效率是平均蛋白质原子的有效电子数（6.7；Hendrickson&Teeter，1981). 结构图使用PyMOL公司（DeLano，2002年).

2.2.X射线荧光测量

X射线荧光（XRF）分析是在瑞士光源的菲尼克斯光束线上进行的，入射辐射能量为4.1 keV，高于CaK边缘（4.038keV）并且当前在大多数MX波束线处不可访问。晶体直接贴在碳胶带上，装入10⁻⁴ Pa真空室。能量分散X射线荧光使用Roentec公司生产的具有180 eV能量分辨率的单元素固态探测器在室温下记录光谱。测量100×100µm的X射线束指向晶体的中心。在120秒的收集时间内，没有任何光束损坏的迹象。XRF光谱拟合使用PyMca公司（索莱等。, 2007)提取被测晶体体积的元素组成。该软件使用高斯形状的发射线和与能量相关的光电截面，根据对应于不同原子能级跃迁的单峰提供元素组成。

3.1. 本地SAD阶段化

3.1.1. DgkA公司

完整膜二酰甘油激酶DgkA在非对称单元代表6×130个残基，总分子量为84kDa。这个下部结构含有6×2蛋氨酸、6×1半胱氨酸和锌离子（图1一)对应于6 keV时1.1%的理论Bijvoet比率。之前在锌的SAD和MAD尝试吸收边缘未成功。该结构最初是通过使用衍射到2.05º分辨率（Li等。, 2013). 当前研究中使用的晶体衍射分辨率仅为2.6º（参见§2.1.1). 收集了具有和不具有多晶体取向的数据（表1).下部结构标识使用SHELXD公司在4º分辨率下成功剪切数据E类值大于1.5；19个地点中有14个被确定，其中11个是使用情景喜剧带有参考PDB条目3季度3（李等。, 2013). 1000后获得的唯一正确解SHELXD公司尝试有CC_全部的和CC_虚弱的值分别为26.2和12.0（图2一). 正确的手是在SHELXE公司。通过搜索自动跟踪α-螺旋在十个循环后产生364个残留物（780个）（图2b条)与43.95%的数据具有良好的相关性。得到的电子密度图（图3一)显示了模型-映射的互相关SHELXE公司映射到66.8%的最终模型。

图1 本地SAD结构。(一)DgkA和(b条)Cas9–RNA–DNA。蛋白质显示为灰色卡通，核酸主干为橙色。异常散射体被描述为彩色球体。

图2 SHELX公司输出。(一)SHELXD公司1000次试验DgkA的子结构确定输出。(b条)SHELXE公司十个自动跟踪周期后的DgkA输出。(c（c）)SHELXD公司Cas9 1000次试验的子结构确定输出。(d日)SHELXE公司三个自动跟踪周期后Cas9的输出。(e（电子）)SHELXD公司 下部结构T的测定2R-TTL有1000个试验。(（f）)具有相位调整和密度调整的三个链追踪循环SHELXE公司对于T2R-TTL。

图3 之后的实验地图SHELXE公司定相和密度修改，在2处绘制等高线σ. (一)DgkA地图。(b条)Cas9–RNA–DNA图谱。

分析下部结构数据说明了异常数据的弱点，主要是由于链中无序的Met66和Cys41E类和F类因此，该样品1%的实验Bijvoet比率低于1.1%的预期理论值。

3.1.2. Cas9–RNA–DNA

CRISPR相关蛋白Cas9是一种RNA引导的核酸内切酶，已被重新用于基因组编辑和基因表达控制。Cas9–RNA–DNA复合物，低对称结晶空间组 C类最初用从硒代蛋氨酸和铱衍生物（Anders）中获得的SAD相解决等。, 2014). 对于本地SAD阶段化实验，我们使用了Cas9–sgRNA–靶DNA复合体的晶体，其中互补DNA链在位置1–3处与导向RNA不匹配（参见§2.1.2). 这个非对称单元含有1371个氨基酸，83个RNA核苷酸和39个DNA核苷酸（总分子量～200 kDa），24个S原子和120个P原子（图1b条)，其中包括最大的下部结构通过迄今为止的本地SAD分阶段解决。在这种情况下，从三个天然晶体中收集数据，在波长为2.066º的多个方向上衍射到～2.2º的分辨率，并在最初尝试从反常峰定位硫和磷位置时合并数据（表1). 这个下部结构1000即可获得溶液SHELXD公司使用2.6º的高分辨率截止值搜索65个站点的试验，不包括E类值低于1.2（图2c（c）). 该计划最初确定了使用SITCOM公司带有参考PDB条目4个月5（安德斯等。, 2014).SHELXE公司 下部结构 精炼完成了下部结构至114个位置，导致非常清晰的手部分离（图2d日). 搜索的三个链跟踪循环α-螺旋线形成了一个易于解释的地图（图3b条)构建C_α三个循环后1060个残留物链（1372个）（图2b条)与数据的相关性为28.75%。模型–映射SHELXE公司最终模型的映射率为68.0%。

只有使用从多个方向收集的三个晶体中合并的数据，才能成功确定亚结构。由新数据集的合并（来自同一晶体的新取向或来自额外晶体）导致的异常峰值高度的增加如图所示。4我们将每个晶体（或晶体位置）上的累积剂量限制在保守的～2 MGy，以尽量减少辐射损伤的影响。额外剂量带来的附加信息很少；在晶体1的情况下，我们观察到异常信号中的增益小到超过2MGy，并稳定在4MGy（补充图S2）。

图4 Cas9-RNA-DNA合并数据集前70个异常峰的平均异常峰高。从三种不同的晶体中合并了总共3×360°的数据集。在两个完全分离的位置收集第一个晶体的数据（补充图S1b条，晶体1）。X射线剂量（上限x轴）每个位置的累积量约为2 MGy。

3.2.X射线荧光分析

在晶体结构可能很难。低能耗数据收集的另一个好处是反常散射从这些元素中的一些可以帮助他们正确分配（米勒-迪克曼等。, 2007). 就Cas9–sgRNA–DNA复合物而言，某些离子最初被建模为Mg²⁺（PDB条目4个月5)显示强烈异常信号（>10σ)，建议替代原子分配。然而，不可能从反常的峰高或现场化学结构的检查中明确确定相应的元素。随后，其中一种晶体被用于收集入射能量为4.1 keV的荧光光谱（见§2.2). 光谱证实了K的存在⁺（图5)可能是结晶条件引起的（缓冲溶液含有250 mM（M）KCl和300 mM（M）KSCN）。因此，我们重新分配了6 Mg²⁺以K表示的离子⁺发现了另外一个离子。后续精炼的反常散射贡献（f）''，如菲尼克斯定义（回声等。, 2014)，给出（f）′′（K⁺)值介于1.58和1.72e之间，与1.77e的理论值一致。

图5 以4.1 keV的入射能量记录的Cas9–RNA–DNA晶体的X射线荧光光谱对数标度。测量的光谱绘制为黑点，拟合为黑色（总计）和彩色（针对不同元素）线。主要贡献（橙色）来自钾Kα1,2 (K–L（左）三和K–L（左）二)以及Kβ1 (K–M（M）三)特征线。1.5到2 keV之间的较小（橙色）峰代表K–Si逃逸峰，是测量的伪影（Papp&Campbell，2001). 硅峰（绿线）来自晶体支架。

3.3. 挑战本机SAD阶段的最佳数据收集策略：T₂R-TTL作为测试用例

T型₂R-TTL是一种由微管蛋白（T）、微管失稳和类stathmin蛋白RB3和微管蛋白修饰酶微管蛋白酪氨酸连接酶（TTL；Prota，Magiera等。, 2013). 这个非对称单元，由两部分组成α-微管蛋白，两个β-微管蛋白，一个RB3，一个TTL，两个GTP，两个GDP和一个AMPPNP分子，由2317个氨基酸组成（总分子量约266 kDa），具有下部结构具有118个S、13个P、3个Ca和2个Cl位点。遵循我们之前成功的T结构解决方案₂R-TTL通过使用单晶、多方向数据收集策略的本地SAD相位调整（Weinert等。, 2015)，我们决定使用该系统来评估多方向、多晶体组合策略的效益。T型₂R-TTL是一个具有挑战性的测试用例的优秀示例；它有一个大非对称单元以及大量散射体，如下图所示，它形成了质量可变的晶体。

使用从单个T测量的多个本机SAD数据集₂R-TTL晶体（参见§2.1.3和补充数据），无法确定下部结构。这可能是因为当前研究中使用的晶体质量低于原始研究中观察到的晶体质量（Weinert等。, 2015). 一个下部结构解决方案SHELXD公司只有合并来自三个不同晶体的数据集，每个晶体在八个不同方向上测得（表1和补充数据）搜索75个站点，分辨率截止值为3.3ºE类值大于1.5（图2e（电子）). 成功的SHELXD公司子结构解决方案具有CC_全部的和CC_虚弱的分别为36.9和18.2。使用确定的正确站点数量SITCOM公司带有参考PDB条目4wbn（世界银行），为86，使用时增至111下部结构 精炼在里面SHELXE公司密度调整导致双手明显分离（图2（f）). 搜索的三个链跟踪循环α-螺旋线产生了一个易于解释的地图，构建了一个C_α三个循环后1669个残基链（2319个残基中的），与数据的相关性为28.75%。模型–映射SHELXE公司最终模型的映射率为78.5%。

通过比较四种数据收集策略的平均异常峰值高度来评估合并来自多个方向的多个晶体的低剂量数据的优点，这在合并统计中很容易观察到（见补充数据）：（i）来自单晶的高剂量单方向；（ii）来自单晶的低剂量、多方位；（iii）合并来自三个晶体的高剂量、单向数据；和（iv）合并来自三个晶体的低剂量、多方位数据（图6). 高剂量下的单方向扫描仅给出了10以上的23个异常峰值σ，这不足以成功下部结构解决方案。尽管累积剂量高出三倍，但合并来自三种不同晶体的高剂量数据导致了10个以上的50个异常位置σ类似于合并来自单晶的低剂量、多方向数据。然而，这仍然不足以取得成功下部结构解决方案。这个下部结构只有当来自三个晶体的低剂量、多方位数据集合并时，搜索才成功，得到了10个以上的70个异常位点σ这与我们之前的研究一致，其中下部结构通过合并来自单晶的低剂量、多方位扫描，成功实现了溶液和自然SAD定相，给出了10个以上的80个异常位置σ（韦纳特等。, 2015). 这也与一项研究表明的一致下部结构当异常差分图中的平均峰高高于某一阈值时，搜索往往是成功的（班科奇等。, 2015); 对于T₂R-TTL晶体，该阈值约为10σ（图6中的虚线).

图6 不同数据收集策略的异常峰值比较。对于T的四种数据收集策略，显示了前100个峰值的异常峰值高度2R-TTL数据集：（i）高剂量、低多重性、单晶位置的单方向（红色），（ii）低剂量、高多重性、晶体位置的多方向（砖），（iii）合并来自三个晶体（蓝色）的高剂量、单方向数据，（iv）合并低剂量，来自三个晶体（绿色）的多方位数据。对于每个晶体，在两个良好分离的位置以相同的剂量收集数据。虚线表示10σ门槛。箭头指向10以上的最后一个峰值σ并显示高于此阈值的站点数。

综上所述，将这两种数据收集策略结合起来有明显的好处：（i）低剂量、多方向方法有效地提取尽可能多的异常数据，同时将辐射损伤降至最低；（ii）如果单晶样品的异常信号不足以成功定相，来自多个统计等效晶体的数据集可以合并。结合这两种方法意味着需要更少的晶体样品。此外，对于相同的累积剂量，使用高剂量、单向策略收集的数据集与使用低剂量、多向策略收集的合并数据集之间的衍射分辨率没有差异（表1以及补充数据）。