2.1. 散射和吸收的波长依赖性

在X射线与物质相互作用的过程中，会发生各种物理过程。这些过程可以分为弹性散射其中没有能量损失，非弹性康普顿散射（有能量损失）和与本例最相关的光吸收。在最后一个过程中，入射辐射被吸收，导致电子从原子中喷射出来。这种行为是元素特有的，并且表现出对入射辐射波长的强烈依赖性，表现出所谓的吸收边。散射过程随着波长的变化而更加平滑。

散射和吸收不仅发生在晶体内部，也发生在任何周围材料以及入射和衍射光束路径内。对于大气压力下的常规光束线，长波辐射随距离的衰减变得非常显著。图1(一)显示了波长范围为1到6º的空气通过多个路径长度的传输。除了这种衰减导致的信号减弱外，光束路径内的X射线散射还会在探测器上产生背景噪声，从而限制数据质量。使用轻气体（如氦气）可以大大降低这些因素，或者原则上通过在真空中进行实验来消除这些因素。

图1 X射线在不同长度空气中的传输是波长的函数(一)，溶菌酶的质量衰减系数(b条)和归一化剂量加权衍射强度我E类(c（c）)和归一化剂量加权异常衍射强度差Δ我E类(天)用于不同大小的等长溶菌酶晶体。

入射光束强度的降低与光束通过的材料厚度成指数关系。这个过程可以用线性吸收系数 μ_我这是材料化学成分和密度的特征。微观上，通过原子横截面的概念，可以通过材料中单个原子的叠加来理解这一点。这个线性吸收系数可以表示为基于材料的化学组成的每个元素的原子的效应的总和，

哪里N个_A类是阿伏伽德罗数，MW是分子量，ρ是密度，x个_我是类型的原子数我从化学公式和σ_一我是吸收横截面不同元素的我.图1(b条)显示了对线性吸收系数溶菌酶在波长范围为1-6º的不同物理过程中的溶菌酶XOP公司（Sánchez del Río&Dejus，2011年). 光吸收支配着材料的线性衰减。

The imaginary part of the反常散射系数与吸收成正比横截面原子的，如

哪里第页_{e（电子）}是电子的经典半径λ是波长。

2.2。本地SAD的最佳波长

在重原子存在的情况下，在可调X射线源上进行MAD或SAD实验的波长选择是在一个可接近的位置或附近吸收边缘。对于本地结构的长波长相位测定，波长的选择不太明确，因为必须在距离吸收边缘。现有光束线的实验表明，最佳波长约为2.1°（米勒-迪克曼等。, 2005).

从理论上看，最佳波长取决于样本大小。对于较小的样品，在没有辐射损伤的情况下，更长的波长变得更有利，因为弹性散射 横截面超过了吸收造成的损失（Rosenbaum&Holmes，1980; 捷普利亚科夫等。, 1998). 考虑到辐射损伤，波长越短，衍射实验越有效（Arndt，1984). 为了计算自然SAD实验的最佳波长，需要考虑朝向硫和磷边缘的异常信号的增加。

当远离吸收边缘，虽然靠近边缘时速度较慢。两者都是线性吸收系数 μ_我以及散射因子的虚贡献Δ（f）“”与吸收成正比横截面（方程式2和3). 阿恩特（1984）)给出了在假定固定辐射剂量的情况下，在存在辐射损伤的情况下布拉格反射的积分强度随波长的变化的估计，

在这里，吨是表征等轴晶体尺寸的线性尺寸。该方程基于以下假设：X射线引起的辐射损伤与所考虑波长范围内的吸收剂量成正比（Owen等。, 2006). 在图1中(c（c）)布拉格强度我_E类根据不同大小的溶菌酶晶体的波长绘制，并将其归一化为λ= 2 Å. 可以看出，衍射实验对于较长波长的波长效率较低，并且严重依赖于晶体尺寸。

对于自然相位实验，强度差异(Δ我_E类)由异常引起的下部结构而不是强度(我_E类)应该进行优化。Hendrickson&Teeter（1981）对Bijvoet差异进行了估计),

N个_T型和N个_A类分别是原子总数和反常散射体总数。Z轴_效率是蛋白质非H原子中的平均电子数，其值通常约为6.7。Δ我/我与成比例Δ（f）''自Δ我/我=2ΔF类/F类取Arndt公式（3）的乘积亨德里克森和蒂特公式（4），可以预测Bijvoet差异的大小。这可以解释为测量考虑辐射损伤的反常相位实验的效率，

图1(天)显示（5）的图用于不同大小的溶菌酶晶体。为了便于比较，将所有曲线归一化为波长为2º的值。

总之，对于自然反常相位实验，与布拉格强度类似的晶体尺寸依赖性(我_E类)观察到。然而，对于布拉格强度而言，短波是最佳选择（图1c（c）)，当测量小于200µm的样品的Bijvoet差异时，最佳波长被移动到2º以上的波长（图1天). 实际上，围绕晶体的其他吸收但非晶体材料和探测器效率将定性地将曲线的峰值转移到较短的波长。然而，对于小于50µm的晶体尺寸，正如目前在第三代同步加速器中研究的样品的典型情况一样，超过标准MX光束线所提供范围的波长将是有益的。

2.3. 增加衍射角

考虑长波长实验时的一个主要限制是布拉格定律表示的衍射角增加。图2显示分辨率(天间距）作为不同波长衍射角的函数。要达到至少天=3º，很明显，对于λ=4°衍射角大于2θ=90°必须可接近。在小分子晶体学中，这通常是通过在不同的检测器2收集几次数据扫描来实现的θ偏移。由于辐射损伤，这种方法在大分子晶体学中并不理想。因此，需要一个覆盖样品周围大范围衍射角的探测器阵列。理想情况下，该阵列应为球形，但几何方面（如测角仪和样本变换器的空间要求）有利于扁平模块的圆柱形布置。这可以通过像素阵列检测器轻松实现，像素阵列检测器通常由矩形模块构成。

图2 分辨率是不同波长布拉格角的函数。

2.4. 数据收集策略

对于圆柱形探测器的几何结构ω测角仪的轴向长波方向显著增加（Dauter，1999). 此外，圆柱形探测器的形状产生了不利的纵横比，因此覆盖不均匀倒易空间。因此，只有使用多轴测角仪才能获得低对称空间群中晶体的完整数据，该测角仪允许晶体重新定向。由于实验受到辐射损伤的限制，因此从给定的样品中获得最佳效果非常重要。几何数据收集策略正在开发中，考虑到束线几何、阴影和碰撞，以优化SAD或MAD实验的异常差异测量。

2.5. 优化我/σ

为了准确测量异常差异，必须减少所有噪声源和仪器误差。如1946年Perutz在室温下对干燥的蛋白质晶体所证明的那样，在真空中进行实验可以消除晶体和光阑之间从空气通道到晶体的散射（Perutz&Rogers，1946). 真空样品环境，结合单光子计数探测器技术（Broennimann等。, 2006)，将测量的背景降低为仅从晶体及其底座散射的X射线。光束线的光学设计提供均匀光束，照亮整个晶体体积和底座。在实验过程中，将晶体浸入X射线束中可以保持衍射体积恒定。这将有助于吸收校正，以补偿不同路径长度反射的衰减，这取决于晶体形态和方向。此外，低温气流引起的晶体振动已被证明是仪器误差的主要来源（阿尔基尔等。, 2008; 弗洛特等。, 2006)，通过在真空中采用传导冷却概念来消除。

2.6. 吸收校正

如前几节所述，吸收是长波长MX的一个限制因素。吸收不仅会导致辐射损伤，还会衰减样品中的衍射X射线。因此，所有测量的强度都必须根据X射线穿过晶体及其周围材料的路径长度进行校正。经验吸收校正可以在后细化步骤中进行。它们通常基于精炼使用对称相关反射的强度模拟吸收表面的球谐函数（Blessing，1995). 因此，在低对称性空间群中，经验吸收修正的适用性是有限的。

大分子晶体的X射线层析成像可以在光束线坐标系（Brockhauser）中重建衍射和非衍射材料的形状和体积等。, 2008). 长波束线有一个X射线层析成像相机集成在终端站的设计中。由此产生的三维模型将允许计算所有测量反射的路径长度，作为分析吸收校正的基础。

晶体的制备和安装非常重要，因为最小化晶体周围的非衍射材料将降低吸收效应。

3.1. 真空度

对于波长高达4º的波长，当压力低于100 Pa时，空气吸收和散射效应可以忽略不计。然而，蛋白质样品必须保持在低温下，这就要求更严格的真空度。其主要原因是低温泵效应：残余气体在真空中冷凝在冷物体表面，逐渐形成吸附分子层。由于X射线的吸收和散射，这一增加的层将导致数据质量的恶化。此外，低温冷却系统冷表面上的冷凝会增加热辐射的吸收，从而降低冷却效率，并导致系统所有组件（包括蛋白质晶体）逐渐升温。假设自由分子流和单位粘附概率，保守估计确定目标压力为10⁻⁴ I23样本环境的Pa。考虑到水蒸气是真空环境中的主要残留物，该模型表明，在2.5小时内，冰的生长速度约为1µm。

3.2. 传导冷却

蛋白质晶体直接暴露在空气中时会迅速干燥，这一过程在真空中会大大加快。因此，在样品转移和真空实验期间，样品需要保持在低温下。大多数MX实验都是在100 K左右进行的，以缓解辐射损伤问题（Garman，1999). 研究表明，进一步降低温度至100 K以下是有益的，因为它可以降低二硫键的整体损伤率和特定损伤率（Meents等。, 2010). 真空环境中的冷却完全取决于导热性。一个基本温度为8K的脉冲管冷却器连接到真空容器上。晶体通过一系列铜链路进行冷却，从而为冷却器提供导电路径。柔性连杆允许围绕三个角度旋转自由度卡帕测角仪。测角头的目标温度为30 K，允许沿冷却路径的温度上升22 K。进行了系统研究，以深入了解热导率通过由几种材料和界面组成的系统。这包括在20–100 K的温度范围内测量易碎铜-铜接头的热接触电导和冰的电导率（Mykhaylyk等。, 2012; Mykhaylyk&Wagner，2013年). 结果指导了样品架和测角头的开发。钕磁体提供了良好的易碎热界面所需的12 N的必要接触力。

样品架是样品架组件中最关键的部分。虽然它必须具有机械强度以支撑晶体，但它还必须能够有效地去除样品中的热量，而不会造成显著的X射线吸收和散射。有限元分析表明，10µm厚的样品架应具有导热系数超过5 W m⁻¹ K（K）⁻¹在X射线衍射实验期间，保持样品架上的温升低于20K。

用金属丝和导电聚合物杜邦-卡普顿50FPC制成的样品架进行了初步实验。金属环提供了有效的冷却，但由于其高X射线吸收率，与长波MX不兼容。这个热导率杜邦聚合物支架不足，导致蛋白质样品过度升温。检查了许多材料的导热系数衍射实验的适用性。结果表明，类金刚石（DLC）、化学气相沉积（CVD）金刚石或玻璃碳等碳基薄膜满足这些要求。在这个阶段，最有希望的是玻璃碳Sigradur K，与其他材料相比，它具有更好的机械性能，并已用于中子衍射实验（Romoli等。, 2014). 需要进一步发展，以优化其在长波长真空MX实验中的使用。

3.3. 样品转移

晶体从液氮传输到I23真空内终端依赖于一个适用于低温电子显微镜样品传输的低温传输系统（Leica VCT100）。该系统包括一个装载站、一个航天飞机和一个连接到I23真空容器的对接站。一次最多可以将四个放置在铜样品块上的样品架从装载站的液氮浴转移到冷转移梭。扩展坞起到装载锁的作用，允许铜块从穿梭机安全进入真空容器内的样品酒店。样品酒店可在五个街区内容纳总共20颗水晶。夹钳机构在酒店和测角仪之间传输样品。采样过程的所有阶段都由机器视觉系统监控。图3中可以看到带有三个样品架和一个空位置的样品块。

图3 铜传输块中的三个样品架。一个位置是空的。

3.4. 光束线布局

主要光束线组件如下。X射线由2米U27真空波荡器产生。带有两个硅晶体（111切割）的双晶单色器（DCM）可以提供高达5.9º的波长。两对水平偏转镜用于聚焦和谐波抑制。第一对反射镜以矢状和切线方向聚焦光束，而第二对的两个平面反射镜用于抑制通过DCM的高次谐波，这在较长波长下尤为重要。光束可以聚焦到大约120×120µm的中等尺寸。这将使尺寸高达80µm的晶体均匀发光，以简化吸收校正。靠近样品的缝隙可以提供较小的光束尺寸。整个光束线波长范围为1–5.9º，针对1.2至4º范围内的实验进行了优化。

为了避免长波X射线的衰减，光束线是无窗口的。这意味着终端，包括样品环境和检测器，直接连接到储存环真空，这是通过沿不同束线段的差分泵送实现的。

3.5. 测角仪

反卡帕几何中的多轴测角仪（Brockhauser等。, 2011)目前正在建设中（图4（左）由英国天文技术中心（英国ATC）提供。使用α角度为50°时，可以沿任意给定的晶体轴排列晶体。沿均匀轴对齐，可以在相同的衍射图像上以相同的吸收X射线剂量测量Friedel对。这可以减少实验相位实验中的辐射损伤效应，因为导致异常差异的两个结构因素受到同等影响。与传统的卡帕测角仪不同，导电冷却环将样品温度保持在50 K以下。为了在机械复杂卡帕测角仪的建造过程中操作光束线，已经安装了一个单轴测角仪，目前正在使用。

图4 调试期间的卡伯角度计（左）和安装前的Pilatus 12M（右）。

3.6条。探测器

I23光束线配备了一个大型弯曲的Pilatus 12M区域探测器（图4，右侧）。在项目开始时，没有适用于真空长波结晶学的合适探测器技术。与Dectris合作，进行了一系列实验来评估现有的Pilatus像素阵列技术（Broennimann等。, 2006)在这些条件下（Marchal&Wagner，2011; 马查尔等。, 2011). 最近的定量研究表明量子效率Pilatus技术，用于在真空中检测长波X射线，甚至超过I23波长范围λ=7º（韦内克等。, 2014).

Pilatus 12M探测器由120个Pilatus2 100k模块组成，这些模块以半圆柱形几何形状排列，由24组五个模块组成，半径为250 mm。其角度范围为2θ=沿赤道40.3°（圆柱轴）至2θ=沿中央子午线±100°。模块水冷至10°C，可在低于10的压力下运行⁻⁴ 宾夕法尼亚州。所有模块都已在长波长下进行校准，并且Dectris还提供了一套额外的超低增益设置，用于在更长波长下运行。

4.1. 结晶和样品制备

在19°C下，通过坐滴蒸汽扩散法获得晶体。通过混合等量的40 mg ml⁻¹索姆丁（Sigma–Aldrich，目录号T7638）在DTNB饱和去离子水中的溶液，结晶缓冲液由0.5组成M（M）酒石酸钾/钠，0.05M（M）ADA pH 6.8，20%甘油。使用导热杜邦-卡普顿支架直接从结晶液滴中收集晶体，并将其浸入一滴NVH油（MiTeGen）中，然后放入液氮中冷冻。

4.2. 数据收集和处理

将一个索姆丁晶体（约200×70×70µm）暴露于1.378º波长的X射线下，在Pilatus 12M探测器上以0.1°的旋转增量和0.1 s的曝光收集数据。衍射数据与XDS公司（卡布施，2010年)和缩放比例无AIMLESS（Evans&Murshudov，2013年). 重原子下部结构由确定SHELXD公司（谢尔德里克，2010年)并使用自动SHARP（冯海因等。, 2007). 自动建模由执行ARP协议/弯曲（兰格等。, 2008)并在年完成人工建筑库特（埃姆斯利等。, 2010).菲尼克斯（亚当斯等。, 2010)用于精炼并使用SUPERPOSE（叠加）在里面中央对手方清算所4（克里斯内尔等。, 2004). 异常差值傅里叶图由阳极（Thorn&Sheldrick，2011年).