2.1. 克隆和蛋白质纯化

这个哦哦基因(或22)被放大了东方Amycolatosis orientalis基因组DNA聚合酶链反应将其亚克隆到表达载体pET-28a（+）中，以产生具有N末端His的蛋白质₆标签。将表达质粒转化为大肠杆菌通过电穿孔培养BL21（DE3）细胞，并在含有50µg ml的LB琼脂平板上培养细胞⁻¹卡那霉素在37°C下放置16小时。单个菌落在含有50µg ml的5 ml LB培养基中培养过夜⁻¹37°C下的卡那霉素。细胞培养物用于接种1 l LB培养基，该培养基含有50µg l⁻¹卡那霉素。对于蛋白质表达和纯化大肠杆菌培养细胞，用200µl 1.0诱导M（M）OD处的IPTG₆₀₀0.6，并在16°C下再生长24小时。通过离心收集细胞，将其重新悬浮在20 ml结合缓冲液（20 m）中M（M）HEPES pH值7.5500 mM（M）氯化钠，10米M（M）咪唑、10%甘油），并使用微流控器或超声波进行裂解。以16000转/分离心后的裂解液上清液⁻¹在镍上涂抹30分钟²⁺–NTA树脂柱。用10 ml结合缓冲液（50 mM（M）HEPES pH 8200米M（M）氯化钠，20米M（M）咪唑）和10 ml洗涤缓冲液（50 mM（M）HEPES pH值8200 mM（M）氯化钠，80米M（M）咪唑），然后用10 ml洗脱缓冲液（20 mM（M）HEPES pH值8500 mM（M）氯化钠，250米M（M）咪唑）。使用配备HiLoad 16/60 Superdex 200色谱柱（Amersham Bioscience）的KTA FPLC系统在等容条件下（20 m）进行凝胶过滤M（M）HEPES pH值8100 mM（M）氯化钠）。

2.2. 结晶和数据收集

纯化的蛋白质用吊滴蒸汽扩散法结晶。Hmo及其Y128F、Y128C和R163L突变体浓缩至7 mg ml⁻¹50米M（M）HEPES pH 8.0缓冲溶液，并使用含有35%塔西米特（0.1）的溶液结晶M（M）双三丙烷pH值7.0，体积比50:50。在20°C下，VDX48板（汉普顿研究所）中的密封剂在五天内出现晶体。对于Hmo及其突变体与(S公司)-扁桃酸（SMA）、苯甲酰甲酸（BF）、苯甲酸（BA）、苯丙酮酸（PPY）、草酰乙酸（OAA）或扁桃胺（MAAD），每个晶体用10-30 m浸泡M（M）数据采集前，指定配体在母液中溶解10分钟至24小时。在收集数据之前，将所有晶体转移到含有低温保护剂的溶液中，并在液氮中闪蒸冷却。Hmo和Y128F突变体的冷冻保护剂溶液含有20%(w个/v（v）)甘油和35%塔西米特。台湾国家同步辐射研究中心的束线13B1、13C1、15A1或05A或日本SPring-8的束线44XU上，使用ADSC Quantum 315或MX300HE CCD探测器在100 K的工作温度下记录X射线衍射数据。所有的晶体都属于同一种空间组： 我422

2.3.结构确定和精细化

使用香港（HKL）-2000年包装（Otwinowski&Minor，1997). 晶体结构由分子再置换（MR）方法确定，使用相位-MR来自中央对手方清算所4套房（McCoy等。, 2007; 优胜者等。, 2011). 这个晶体结构羟酸氧化酶（PDB条目3平方米; 陈等。, 2012)作为求解初始阶段的搜索模型。多肽结构是使用REFMAC公司（穆尔舒多夫等。, 2011). 模型构建和后续迭代周期精炼使用执行库特（埃姆斯利等。, 2010)以及菲尼克斯（阿富宁等。, 2012). 用各向异性位移参数对所有非H原子进行了细化。蛋白质结构和电子密度图均使用PyMOL公司（德拉诺，2002). 详细的细化统计如表1所示.

表1 数据收集和细化统计Hmo及其Y128F、Y128C和R163L突变体 括号中的值表示最高分辨率的shell。SMA、(S公司)-扁桃酸；BF，苯甲酰甲酸酯；FMN，核黄素单核苷酸；5DAFMN，5-去甲氧基黄素单核苷酸；PPY，苯丙酮酸；MA_FMN，丙二酰–FMN；MAAD_FMN，曼德拉胺–FMN。   嗯 嗯-SMA 嗯-BF 128F日元 Y128F–座椅模块组件 Y128F–高炉 Y128F–5天 Y128F–5DAFMN–BA PDB代码 5磅 5盎司 2008年6月 6a13号机组 6a0伏 6a19号 6a1小时 6a11号 数据收集  波长（Ω） 1 1 1 1 1 1 1 1  “空间”组 我422 我422 我422 我422 我422 我422 我422 我422  一,b条,c（c）(Å) 137.9、137.9、112.3 137.7, 137.7, 111.6 137.9, 137.9, 111.8 137.5, 137.5, 112.0 137.8, 137.8, 111.8 137.9, 137.9, 112.3 137.4, 137.4, 112.4 137.7, 137.7, 111.6  α,β,γ(°) 90, 90, 90 90, 90, 90 90, 90, 90 90, 90, 90 90, 90, 90 90, 90, 90 90, 90, 90 90, 90, 90  分辨率范围（Ω） 30–1.39 (1.44–1.39) 30–1.31 (1.36–1.31) 30–1.55 (1.61–1.55) 30–1.70（1.76–1.70） 30–1.39 (1.44–1.39) 30–1.55 (1.61–1.55) 30–1.36 (1.41–1.36) 30–1.40 (1.45–1.40)  R（右）合并†(%) 3.7 (73.0) 3.7 (67.0) 4.0 (79.0) 3.5 (69.2) 4.3 (73.1) 3.6 (75.0) 2.8 (62.0) 4.2 (81.0)  〈我/σ(我)〉 36.1 (2.4) 34.5 (2.3) 43.1 (2.9) 41.3 (3.1) 41.0 (2.9) 32.9 (2.7) 41.2（3.4） 29.6 (2.4)  完整性（%） 99.9 (100.0) 99.0 (100.0) 100.0 (100.0) 100.0 (100.0) 100.0 (100.0) 99.9 (100.0) 99.9 (100.0) 100.0 (100.0)  多重性 9.4 (9.4) 9.8 (9.5) 12.8 (11.2) 11.2 (11.1) 12.2（12.0） 9.6 (9.2) 9.7 (9.4) 10.5 (10.4) 精炼  分辨率范围（Ω） 30–1.39 (1.44–1.39) 30–1.31 (1.36–1.31) 30–1.55 (1.61–1.55) 30–1.70 (1.76–1.70) 30–1.39 (1.44–1.39) 30–1.55 (1.61–1.55) 30–1.36 (1.41–1.36) 30–1.40（1.45–1.40）  R（右）工作‡(%) 17.0 (28.0) 16.6 (22.9) 16.9 (22.0) 17.8 (24.2) 16.7 (22.9) 15.7 (24.4) 16.8 (23.0) 17.5 (28.0)  R（右）自由的§(%) 18.3 (30.0) 17.7 (22.3) 17.9 (20.1) 20.0 (26.2) 18.4 (23.1) 17.3 (26.6) 18.1 (26.0) 18.6 (30.1)  R.m.s.偏差   粘结长度（Ω） 0.010 0.009 0.008 0.018 0.008 0.009 0.017 0.006   结合角（°） 1.41 1.41 1.26 1.490 1.3361 1.460 1.421 0.982  反射次数 100548 112497 75720 58599 98014 74156 114232 104841  原子数   蛋白质 2785 2622 2684 2510 2636 2703 2548 2574   配体/离子 31 53 65 31 53 53 31 55   水 403 402 329 316 400 400 440 335  B类因子（λ2)   蛋白质 18.2 19.7 19.1 18.6 16.9 21.9 18.4 20.5   配体/离子 10.7 19 20.6 10.8 17.8 29.4 12.1 17.1   水 32.4 33.9 31.7 32.1 32.2 37.3 34.9 26.6   Y128F–5DAFMN–BF Y128F–5DAFMN–PPY Y128F–PPY–FMN Y128F–MA_FMN Y128F–BF–FMN Y128C–高炉 R163L–MAAD_FMN PDB代码 600万 6a1便士 6a1r年 6a21号 6a23号 5盎司 6a3吨 数据收集  波长（Å） 1 1 1 1 1 1 1  “空间”组 我422 我422 我422 我422 我422 我422 我422  一,b条,c（c）(Å) 137.9, 137.9, 111.2 138.0, 138.0, 111.1 138.1, 138.1, 112.1 137.6, 137.6, 112.1 137.8, 137.8, 111.8 138.2, 138.2, 112.1 137.4、137.4、111.7  α,β,γ(°) 90, 90, 90 90, 90, 90 90, 90, 90 90, 90, 90 90, 90, 90 90, 90, 90 90, 90, 90  分辨率范围（Ω） 30–1.55 (1.61–1.55) 30–1.51 (1.56–1.51) 30–1.65 (1.71–1.65) 30–1.50 (1.55–1.50) 30–1.65 (1.71–1.65) 30–1.45 (1.50–1.45) 30–2.51 (2.60–2.51)  R（右）合并†(%) 3.9 (57.0) 3.6 (72.1) 4.4 (73.0) 3.2（64.3） 3.8 (70.1) 4.4 (69.2) 10.1 (66.0)  〈我/σ(我)〉 40.8 (2.4) 30.4 (2.3) 36.8 (3.16) 40.0 (3.2) 28.4 (2.0) 33.5 (2.6) 15.2 (2.4)  完整性（%） 99.7 (97.2) 99.8 (98.3) 100.0 (100.0) 99.9 (100.0) 99.3 (100.0) 99.9 (100.0) 99.9 (100.0)  多重性 11.4 (9.1) 9.4 (7.7) 12.2 (12.1) 9.8 (9.8) 9.1 (8.8) 9.9 (9.9) 9.5（9.3） 精炼      分辨率范围（Ω） 30–1.55 (1.61–1.55) 30–1.51 (1.56–1.51) 30–1.65 (1.71–1.65) 30–1.50 (1.55–1.50) 30–1.65 (1.71–1.65) 30–1.45 (1.50–1.45) 30–2.51（2.60–2.51）  R（右）工作‡(%) 17.8 (25.7) 17.0 (26.1) 16.3 (20.6) 16.7 (22.4) 17.3 (24.1) 17.5 (22.8) 17.8 (21.6)  R（右）自由的§(%) 20.1 (26.5) 19.7 (26.8) 18.5 (22.5) 19.0（22.9） 19.4 (24.9) 19.2 (27.2) 22.4 (29.1)  R.m.s.偏差   粘结长度（Ω） 0.018 0.015 0.019 0.018 0.006 0.010 0.008   结合角（°） 1.501 1.357 1.529 1.557 1.173 1.300 1.29  反射次数 75042 83439 64602 84212 59812 93717 17837  原子数   蛋白质 2485 2539 2586 2626 2606 2481 2496   配体/离子 53 44 41 37 51 42 43   水 298 331 303 375 301 357 91  B类因子（λ2)   蛋白质 19.3 22.2 17.9 19 19.1 18.7 40.29   配体/离子 14.8 18.2 11.7 16.7 16.6 20 40.89   水 34.2 35.2 30.2 33.2 30.4 31.6 38.94 †R（右）合并=，其中〈我(香港特别行政区)\9002；是等效反射的平均强度值。 ‡R（右）工作=. §R（右）自由的根据随机排除在精细化。

2.4. 定点突变

使用QuikChange（Stratagene）生成了定点Hmo突变体Y128C、Y128F和R163L。突变体制备的引物列于补充表S1通过DNA测序证实了这些突变。使用与野生型Hmo相同的方法纯化每个突变蛋白。

2.5. 化学酶法合成5-脱氮黄素单核苷酸

为了获得5-脱氮黄素单核苷酸，商用化合物3,4-二甲基苯胺、氰基硼氢化钠和D类-核糖被用作起始材料，按照补充方案S1.化学合成的脱唑核黄素用柱色谱法，以…为特点质谱法或核磁共振，并通过核黄素激酶转化为具有催化活性的5-脱氮-FMN。核黄素激酶基因编码是从大肠杆菌K12和亚克隆到pET-28a载体中携带N末端His₆标签。然后将构建的质粒转化为大肠杆菌BL21（DE3）细胞过度表达。用镍纯化过表达的蛋白质²⁺–NTA亲和层析并浓缩至15 mg ml⁻¹。反应是通过添加2 mg ml⁻¹核黄素激酶到由pH 7.5、5m的HEPES组成的反应溶液中M（M）ATP，5米M（M）硫酸镁₄和10米M（M）5-deazariboflavin过夜。样品溶液通过HPLC纯化并通过质谱确认。

2.6。含5-去氮-FMN的Hmo及其Y128F突变体的制备

Hmo及其Y128F突变体在Ni上进行脱黄素和重组²⁺–NTA树脂柱，通过循环含有10 m HEPES缓冲液的溶液M（M）脱氮核黄素等。, 2003). 镍²⁺–加载NTA树脂柱，并用目标蛋白溶液以0.2 ml min的流速饱和⁻¹使用安装在样品贮存器和色谱柱之间的蠕动泵，以确保最大限度的结合。十体积变性缓冲液（50 mM（M）HEPES，2个M（M）溴化钾，2M（M）随后使用pH 8.0的尿素来展开Hmo或其Y128F突变体，从而从Hmo或它的Y128F突变株中去除FMN修复辅因子。通过循环50 m的缓冲溶液，用5-deaza-FMN完成柱上更换M（M）HEPES pH 8.0，10米M（M）5-去氮-FMN，最小0.2 ml⁻¹一夜之间。使用10 ml洗脱缓冲液（20 m）洗脱含有5-去氮-FMN的Hmo或其Y128F突变体M（M）HEPES pH值8200 mM（M）氯化钠，250米M（M）咪唑）。使用Superdex 200 16/20色谱柱进行的凝胶过滤分析实验证实，含有5-脱氮-FMN的Hmo（5-deaza-Hmo）及其Y128F突变体在复性后具有不变的四聚体状态。将纯化酶浓缩至10 mg ml⁻¹用于酶分析和蛋白质结晶。

2.7. 5-deaza-Hmo及其Y128F突变体的酶学分析

在200µl缓冲溶液（20 m）中进行典型的酶反应（10µg 5-deaza-Hmo或其Y128F突变）M（M）HEPES，100米M（M）NaCl pH值7.5，5 mM（M） S公司-扁桃酸、苯甲酰甲酸或苯甲酸）在25°C下放置2 h。使用6N个HCl并进行HPLC-MS分析（使用连接至Thermo-Finnigan LTQ-XL的Agilent 1260 Infinity Quantary LC模块）。使用反相C分离分析物₁₈色谱柱（4.6×250 mm，5µm，C₁₈Prodigy，Phenomenex），流速为1 ml min⁻¹在移动系统中，编程为2%到40%溶剂的线性梯度B类抗溶剂A类超过25分钟，然后使用98%的溶剂B类再持续8分钟（溶剂A类，含1%甲酸的水；溶剂B类，乙腈和1%甲酸）。使用波长设置为254/280 nm的紫外线检测器记录数据质谱仪处于正模式。

2.8. Hmo及其Y128F突变体反应的紫外-可见吸收测量

使用Beckman分光光度计（DU-800）记录紫外线和可见光吸收光谱。在水溶液中，新制备的Hmo或其Y128F突变体（0.125 mM（M）0.05英寸M（M）HEPES，0.1级M（M）NaCl pH 7.5）与底物（2.5–5 m）混合M（M）)并在室温下在石英试管中孵育2小时。记录300至600 nm的反应吸收光谱。对于再溶解的晶体/晶体，100多个Hmo晶体或其Y128F突变体（用衬底浸泡5 m后M（M）在光谱扫描之前，从悬滴结晶板中提取2 h），并在紫外石英试管中的母液中重新溶解。

3.1. 抑制α-酮酸

为了研究Hmo单突变体Y128F催化的四电子氧化脱羧反应的机理，我们首先解决了Y128F突变体与不同配体（如(S公司)-扁桃酸盐(S公司)-2-苯基丙酸酯、甲酸苯甲酰酯、苯甲醛和苯甲酸酯。然后比较Hmo及其Y128F突变体的三元配合物，由此观察到叠加配合物在Hmo和Y128F突变之间没有明显的结构变化（r.m.s.d.<0.1º；补充图S2)根据蛋白质和配体的化学构象和空间位置。当晶体被甲酸苯甲酰酯浸泡时，N5苯甲酰-FMN与N5–C′形成加合物α观察到连接[图2(一)]. MS分析证实苯甲酰基部分与FMN共价连接[图2(b条)]. 当晶体被苯甲醛浸泡时，没有观察到共价加合物的形成。这个结果表明α-酮酸部分是形成共价加合物的先决条件，在该加合物中α-酮酸可能发生在N5–C′形成之后α联动装置。此外，当Y128F突变体的晶体浸泡在(S公司)-3-苯乳酸、苯丙酮酸或苯乙酸[图2(一)]，我们观察到(S公司)-3-苯乳酸被氧化为苯乙酸（一种四电子氧化脱羧反应），苯丙酮酸最终成为N5-苯乙酰基-FMN加合物，苯乙酸保持原样。当用草酰乙酸浸泡晶体时，发现N5-丙二酰-FMN加合物[图2(一)]从而得出结论，共价N5加合物的形成是α-酮酸依赖性。

图2 酰基FMN的晶体结构红色加合物及其抑制机制α-酮酸。(一)酰基FMN的结构红色Y128F突变体晶体中的加合物被苯甲酰甲酸盐（左）、苯丙酮酸盐（中）或草酰乙酸盐（右）浸泡。黄素加合物均在硅-异柳氮环的表面(b条)FMN（i）和苯乙酰基-FMN的LC示踪和质谱红色（ii）。(c（c）,d日)加权2F类o个−F类c（c）电子密度图（灰色）和无偏F类o个 − F类c（c）Hmo中FMN的差异OMIT电子密度图（蓝色）(c（c）)和Y128F突变体(d日)没有（左）或有配体(S公司-扁桃体，中心；苯甲酰甲酸酯，右），其中极化程度由OMIT电子密度证明（野生型或Y128F突变以及配体的缺失或存在似乎是关键因素）。第2个F类o个−F类c（c）电子密度图的等高线为2σ; 不偏不倚的F类o个−F类c（c）OMIT差分电子密度图的轮廓为4σ游离配体、FMN、FMN加合物和活性位点残基分别为青色、黄色、橙色和绿色。请参见补充图S3(一),第3章(b条)和S2系列(c（c）)用于立体视图和F类o个−F类c（c）不同的电子密度图。

在大多数黄素依赖者中氧化还原酶FMN_公牛辅因子作为电子库（电泳物），在还原半反应中接受从底物或NADH/NADPH传递的电子或氢化物。真菌中的硝基烷烃氧化酶尖孢镰刀菌人类成纤维细胞中的烷基二羟丙酮磷酸合成酶是两种罕见的情况，在将黄素辅因子N5作为共价加合物（Razeto等。, 2007; 希罗克斯等。, 2009). 然而，在两种电泳（FMN）如何_公牛和α-酮酸）在Y128F突变体中共价结合。一种可能性是α-酮酸首先经过脱羧反应形成局部C′α然后作用于FMN的碳负离子_公牛，但一个α-自发脱羧的酮酸在化学上是不稳定的。第二种可能性是服务提供商²FMN的N5原子_公牛充当亲核剂，但这种情况同样与当前的理解相矛盾：FMN_公牛是一个强大的亲电的接受电子的。然而，FMN N5顶部的额外电子密度块_公牛在无偏差电子密度图中观察到，Y128F突变体中的电子密度比野生型中的更高[图2(c（c）)和2(d日)]. 这个额外的电子密度表明C4α=FMN中的N5双键_公牛极化为C4α⁺–N5⁻ylide（三碳正离子和四面体服务提供商^三胺阴离子），如不均匀的楔形电子密度所示π-债券[图2(c（c）), 2(d日), 3(一)和3(b条)]. 极化程度似乎是活性位扰动系综的函数(例如点突变），反映了水、FMN和活性位点残基以及配体之间氢键网络的协同作用[图3(c（c）)和3(d日)]. 因此，建议加合物的形成如下：服务提供商^三极化FMN的N5原子_公牛攻击α-酮酸形成共价C′α–N5加合物，然后发生脱羧反应，导致局部C′α碳负离子。C′的孤对α碳负离子随后与πN5轨道恢复C4中立αC′坍塌时α氧阴离子，N5-酰基-FMN_红色通过一系列的键重排结果。本种具有对苯二酚类结构，酰基部分伸出由FMN的异恶嗪环定义的平面_公牛[图2(一)].

图3 Tyr128的4-OH对极化、氢键网络和反应性的影响。(一,b条)C4顶部楔形电子密度的特写图α=FMN的N5公牛由无偏差电子密度图（蓝色，正电子密度）显示，轮廓为4σ野生型(一)和Y128F突变体(b条)表明π-C4轨道α=N5从C4极化α至N5（形成C4α+–N5−ylide），这在Y128F突变体中比野生型中更为显著。(c（c）,d日)点突变Y128F扰乱了水、FMN和催化二元体之间的活性位点氢键网络【Y128F突变失去了Tyr128和H之间的氢键2O（187），但在His252和H之间获得了新的氢键2O（257）]。(e（电子）)过氧化氢在C4下建模α式中，Tyr128和C的末端O原子之间的距离α-OOH为2.7奥。(（f）,克)苯甲酰甲酸酯的苯环体积较大，占用空间，限制了氧进入反应中心，而丙酮酸甲酯的甲基体积较小，占用空间较小，允许氧进入反应中枢[在底物入口凸出的苯环(（f）)禁止接触FMN红色相对于中的甲基(克)允许FMN暴露红色至散装溶剂]。因此，衬底的尺寸是影响氧化级联的另一个因素。(小时)除了活性位扰动效应外第页-OH组还引入了一些空间，允许访问O2到C4α氧化还原活性中心。(我)Y128C突变体的巯基（SH）已被氧化为亚砜基（S-OH），因为它易受活性位点产生的ROS的影响。游离配体、FMN和活性位点残基分别呈青色、黄色和绿色。

Y128F突变蛋白溶液的紫外-可见光谱显示出典型的FMN_公牛吸光度曲线[在370和450 nm处的两个吸光度；图4(一)，i]。FMN（飞行管理号码）_公牛当苯丙酮酸被添加到溶液中时变为无色，这表明形成了酰基FMN物种[图4(一)，ii]。光谱与添加苯乳酸时观察到的光谱不同[其中370和450 nm处的两个典型吸光度消失，表明FMN减少_公牛至FMN_红色; 图4(一)，iv）通过340 nm处的小隆起[图4(一)，ii]。用苯丙酮酸预浸过的Y128F突变晶体/晶体的再溶解溶液也变得无色，其轮廓与溶液中的轮廓相似[在340 nm处有较小的隆起；图4(一)（Sucharitakul）等。, 2007; 托萨蓬等。, 2011). O时₂是一种小的疏水性分子，在蛋白质基质的空间和隧道中自由扩散（Baron，McCammon等。, 2009; 莱利·男爵等。, 2009)，Hmo可能已经进化出一个离散的通道或口袋，暂时限制O的访问₂至C4αN5-酰化异恶嗪。亚稳态N5-烷基-FMN_红色因此，在没有Hmo或其Y128F突变体的情况下，水溶液中的电荷转移笼发生功能障碍。这里确定的抑制Hmo和突变体不同于FMN的常规灭活_公牛需要化学活化剂（Walsh，1980, 1984).

图4 5-脱氮-FMN的光谱、合成、反应和结构。(一)Hmo及其Y128F突变体中FMN的紫外-可见光谱：（i）FMN公牛单位Hmo（370/450 nm，绿线），（ii）酰基-FMN红色Y128F突变体[340 nm，蓝线；添加苯丙酮酸（PPY）2小时]，（iii）用PPY（酰基FMN）浸泡的再溶解Y128F突变晶体/晶体中的酰化FMN红色，340 nm，蓝色虚线），（iv）FMN红色在Hmo中【330 nm处的肩部，红色；添加苯乳酸（PLA）]。(b条)（i）5-deazariboflavin的化学合成和液相色谱纯化（插图显示质谱（ii）5-deaza-FMN的酶法合成和液相色谱纯化（插图显示质谱5-deaza-FMN）。(c（c）)Hmo及其携带5-二氮杂-FMN的Y128F突变体的酶反应：（i）在存在下与携带5-二氮杂-FMN的Hmo的酶反应S公司-扁桃酸，（ii）与含有5-去氮-FMN的Y128F突变体在S公司-扁桃酸，（iii）野生型Hmo在存在的情况下的控制反应S公司-扁桃酸盐，（iv）Y128F突变体在S公司-扁桃木。(d日,e（电子）)含有5-deaza-FMN的Y128F突变体的晶体结构S公司-扁桃酸盐(d日)或苯乳酸(e（电子）)分别转化为苯甲酰甲酸酯或苯丙酮酸。与野生型FMN或Y128F突变体不同，C5顶部或C′之间没有出现电子密度α和C5。(（f）)一个α-曼德拉胺-N5-FMN红色R163L突变株经非脱羧基浸泡后晶体中的加合物α-曼德拉胺（化学结构如图所示）。黄素加合物位于硅-异柳氮环的表面。2F类o个−F类c（c）电子密度图的等高线为2σ.无偏见F类o个−F类c（c）差分电子密度图的等高线为4σ正电子密度。游离配体、FMN、FMN加合物和活性位点残基分别呈青色、黄色、橙色和绿色。请参见补充图S2(j个)–S2(米)用于立体视图和2F类o个−F类c（c）不同的电子密度图。

3.2. 氧化过程中的5-脱氧-FMN

A类光还原已提出LMO介导的氧化脱羧反应的机理（Ghisla&Massey，1977, 1989; 吉斯拉等。, 1979)其中反应物需要通过光敏化活化。在本例中（Hmo及其Y128F突变体），C4α⁺−N5⁻FMN的ylide_公牛似乎是关键因素。为了验证这一主张，我们化学酶法合成了1g FMN类似物3,10-二甲基-5-去氮异柳氮核糖醇磷酸酯（5-deaza-FMN_公牛)以下是先前报道的方法[图4(b条); 修改后的方法在辅助信息]（卡尔森和基斯林，2004年; 基特曼等。, 2007; 曼苏洛娃等。, 2008; 奥斯本等。2000年). 生化上，含有5-去氮-FMN的Hmo或其Y128F突变体能够氧化(S公司)-扁桃酸盐转化为苯甲酰甲酸盐，而非苯甲酸盐，证实该酶作为野生型成功复性，并支持N5作为氧化脱羧反应的关键因素[图4(c（c）)]. 类似地，5-deaza-FMN中发现甲酸苯甲酰酯，但没有发现苯甲酸苯酯_公牛-含有Hmo晶体或其Y128F突变体浸泡(S公司)-扁桃木[图4(d日)和4(e（电子）)]. 在用不同浓度的甲酸苯甲酰酯或苯基丙酮酸盐在不同时间间隔浸泡的Hmo或其Y128F突变体的含5-二氮杂-FMN的晶体中，没有发现N5酰基加合物。此外，C5顶部或C5和C′之间缺乏可见电子密度α苯甲酰甲酸盐（4.0º）表明C4α=5-deaza-FMN中的C5双键不太极化。我们的结构询问支持了α-在C′形成之后或与C′形成同时发生的酮酸α–N5债券。使用不可羧化底物进一步检测R163L突变体（一种低活性突变体）α-(S公司)-扁桃胺[2-(S公司)-羟基-2-苯乙酰胺]或苯甲酰胺（2-酮-2-苯乙基酰胺），其中前者被氧化形成后者。当R163L突变晶体被苯甲酰胺浸泡时α-形成了羟胺-FMN加合物[图4(（f）)]从而得出FMN的N5_公牛具有亲核倾向，C′α-N5键形成于α-酮酸脱羧。

3.3. 四电子氧化制苯甲酸酯

我们建议C4α-OOH-N5-酰基-FMN是α-Hmo及其Y128F突变体介导的羟基酸基于以下事实：（i）Hmo及其突变Y128F催化α-羟基酸通过α-酮酸从O变成一个具有一个O原子的酸₂并入末端羧基，（ii）H₂O（运行）₂不能氧化α-不含Hmo或其Y128F突变体的酮酸，（iii）前-R α-酮酸与FMN共价连接_公牛在Y128F突变体中，形成N5-酰基FMN_红色加合物，（iv）氧化级联在α-使用Hmo或其Y128F突变体与5-去氮-FMN的酮酸_公牛代替FMN_公牛和（v）服务提供商^三FMN中的N5_红色具有高度反应性，如UbiX，一种参与细菌泛醌生物合成的黄素-戊基转移酶（白色等。, 2015). 中间体的形成与EncM的机理有点类似，EncM催化氧化Favorskii型重排反应（Teufel等。, 2015). 然而，主要的差异是O₂in-Hmo及其Y128F突变体介导C4的瞬时形成α-OOH-N5-酰基FMN在释放为H之前₂O（运行）₂.

Y128F突变体的苯甲酰甲酸与野生型的三元络合物的重叠没有显示出明显的差异（均方根误差0.06º），除了第页-Tyr128的OH基团(补充图S4). 假设α-羟基酸由Y128F突变体催化执行第页-OH基团应该在氧化级联的杠杆作用中发挥关键作用。这种效应与最近的一份报告相符，即苯丙酮单加氧酶的一个突变C65D通过促进H₂O（运行）₂（布朗达尼等。, 2014). 补体第四成份α-OOH-FMN公司_红色，是典型的单加氧酶/氧化酶催化反应中的反应中间体，在Hmo的结构中进行了建模和优化，其中第页-OH基团在C4的氢键距离（2.7º）内α-OOH[图3(e（电子）)]. 基于此模型第页-OH基团处于质子化C4的位置α-OO（OO）⁻-FMN（飞行管理号码）_红色形成C4α-OOH-FMN公司_红色从而中和或促进H的释放₂O（运行）₂来自C4α-OOH公司。相反，C4α-OO（OO）⁻-FMN（飞行管理号码）_红色在没有第页-OH组。一个暗示是Y128F突变体像单加氧酶一样工作，由此产生Baeyer-Villiger型反应。那就是C4α-OO（OO）⁻阴离子攻击α-碳（C′α)第页，共页前-R甲酸苯甲酰酯形成四面体氧阴离子物种。在α-氧阴离子-末端羧基迁移到C4的远端O原子α-哦⁻形成一个混合的氢化物物种；随后的水解会产生苯甲酸盐和甲酸盐（托雷斯-帕兹米诺等。, 2010). 然而，由于在含有5-脱氮-FMN的Y128F突变体催化的反应中未检测到苯甲酸酯，因此排除了这类反应。然而，这一事实强调了服务提供商^三C4的N5α-OO（OO）⁻-FMN（飞行管理号码）_红色在四电子氧化反应中服务提供商^三N5实际上具有更好的Bürgi–Dunitz角度，并且距离C′较近α属于前-R甲酸苯甲酰酯，有利于C4的形成α-OO（OO）⁻-N5-烷基-FMN_红色释放H之前₂O（运行）₂.

3.4. 氧化脱羧的催化机理

在一般的四电子氧化反应中(S公司)-扁桃酸理论上应产生两个H当量₂O（运行）₂H的摩尔比₂O（运行）₂然而，与苯甲酸盐相比，并没有遵循这个化学计量比（它远小于统一；是的等。, 2019). 相反，这一事实与不成比例FMN过氧化物的反应，其中一个O原子进入苯甲酸盐，另一个最终成为水。为了寻找线索，我们重新检查了Hmo及其与底物（扁桃酸或乳酸）或产物（苯甲酰甲酸或丙酮酸）配体的Y128F突变体的活性位点几何形状。氧化还原活性中心C4α=N5的异恶唑嗪被一组活性位点残基包围[底部为Val78和Ala79，顶部为Tyr（Phe）128和His252]，其中它只能从上前侧进入。当基底和氧化还原活性中心C4时，反应中心被密封以形成适合氢化物转移/电子隧穿的窄而低介电环境α=N5相互靠近。有趣的是，底物对扁桃酸盐/甲酸苯甲酰酯比替代对乳酸盐/丙酮酸盐更适合，因为前者中的苯基团较大[图3(（f）)和3(克)]. 另一方面，Y128F突变体中的氧化还原室由于缺乏第页-OH组[图3(小时)]. 当使用乳酸（含较小的甲基）时，这种缺陷会加剧[图3(（f）)和3(克)]. 在这种情况下，O₂FMN相对容易访问_红色通过时间空间/隧道形成C4α-OO（OO）⁻-发布前的FMNα-酮酸（非乒乓机制）。与此同时赞成的意见-R（右） α-酮酸可通过以下途径获得服务提供商^三N5形成C4α-COOH-N5-氧烷基化-FMN_红色.脱羧后，C4α-COOH-N5-甲氧基-FMN_红色C′α碳负离子结果。C′α分子内攻击C4末端O原子的碳负离子α-然后，OOH导致过氧化物键的异裂。返回C′后α氧阴离子、苯甲酸盐和H₂O的形成与FMN的再生一致_公牛（图5).

图5 Y128F突变体催化氧化脱羧的拟议机制。

过氧化物阴离子自由基：FMN半醌笼对可能从FMN进行单电子转移_红色至O₂在给定的黄素酶中，反应性取决于活性位点极性集合，这些因素包括结合水、电荷分布、氢键、范德瓦尔力等。（Fagan和Palfey，2010年). Y128C突变体（其中笨重的苯基被巯基取代）可以转化(S公司)-使用扁桃酸盐对苯甲酸盐的反应来评估活性位点扰动的程度。Y128C突变体的结构结晶并浸泡(S公司)-扁桃酸盐表明，Y128C突变体的巯基（SH）已被氧化为亚砜基（S-OH），而其他巯基没有改变[图3(我)]. 这一结果表明，Y128C突变体的巯基相对容易获得，并且对局部未调节的活性氧物种（ROS；Chaiyen等。, 2012).