A.阿尔塔米拉诺,L.芬尼德,R.小檗,B.Fürnrorh公司,F.弗雷瑟,A.里奇,A.纳希伯格,T.莱纳克,S.Jonjic公司,G.拜尔,K.Scheffzek公司,H.Dieplinger公司和B.卢比 蛋白质糖基化在蛋白质稳定性、折叠和分泌中起着重要作用,但对蛋白质结晶提出了重大挑战。由于聚糖修饰的构象和化学不均匀性,高糖基化蛋白质的结晶通常很困难。因此,几乎总是有必要对材料进行修饰,以获得可结晶的构象均质蛋白质。(1) 我们已经探索了人类87kDa糖蛋白afamin的几种途径。Afamin(AFM)是白蛋白基因家族的一员,主要在肝脏中表达并分泌到血液中。(2) 阿法明血浆浓度升高与代谢综合征和癌症等主要疾病相关;(3) 然而,其病理生理功能在很大程度上尚不清楚。因此,我们正在研究各种形式的重组表达人afamin(rhAFM)的晶体结构,以指导结构探索和分析其功能。研究了rhAFM的多种变体:1)全糖基化野生型rhAFM(在CHO细胞系中表达);2) rhAFM与两种抗AFM单克隆抗体的Fab片段复合,3)rhAFM和PGNaseF的酶法脱糖,4)部分糖基化的rhAFM(在糖基化缺陷的Lec1-CHO细胞中表达);和5)无糖基化rhAFM,通过用ASP替换ASN,从HEK293细胞中获得,该细胞病毒转染了一个缺失所有5个糖基化位点的cDNA突变。HEK273细胞中高达2 mg/mL无糖基化突变体rhAFM的产量与天然rhAFM相当。Ni-IMAC从无血清细胞培养上清液中捕获C末端His6标记的rhAFM。通过SEC抛光所有变体和Fab-AFM复合物,根据SDS-PAGE和免疫印迹分析产生纯产物。晶体是从Fab碎片和结晶球晶中获得的,它们有助于从Fab-AFM复合物中进行微进给。