新出现的数据表明，双酚A（BPA）的结构类似物，如双酚S（BPS）、四溴双酚A（TBBPA）和双酚AF（BPAF）已作为双酚A的替代品引入市场。我们之前的研究使用小鼠C18-4精原细胞比较了体外睾丸毒性，发现与BPA和BPS相比，BPAF和TBBPA表现出更高的精原毒性。最近，我们开发了一种新型的体外三维（3D）睾丸细胞共培养模型，能够对生殖毒性物质进行分类。在本研究中，我们应用睾丸细胞共培养模型，并采用基于高内容图像（HCA）的单细胞分析来进一步比较BPA及其类似物的睾丸毒性。我们还开发了一种基于机器学习（ML）的HCA管道，以检测与睾丸毒性相关的复杂表型变化。在一项基于单细胞的分析中，我们发现了一系列不良终点的剂量和时间依赖性变化，包括核形态、DNA合成、DNA损伤和细胞骨架结构。共同培养的睾丸细胞对BPA及其类似物的反应比C18精原细胞更敏感。与传统的人群平均分析不同，单细胞分析不仅显示了平均人群的水平，还显示了亚人群的变化。基于机器学习的表型分析表明，BPA及其类似物的治疗导致空间细胞骨架结构的丢失，以及M期细胞以剂量和时间依赖性的方式积聚。此外，BPAF诱导的多核细胞治疗与DNA损伤反应改变和细胞F-actin丝受损有关。总的来说，我们通过ML和基于高含量图像的单细胞分析相结合，证明了一种新的有效方法来评估睾丸共同培养模型中的多个毒性终点。该方法对多维HCA数据进行了深入分析，并对感兴趣的表型进行了无偏见的定量分析。
