的羧基末端结构域的结构结核分枝杆菌CarD蛋白：一种重要的rRNA转录调控因子

最近的出版物表明，结核分枝杆菌（MtbRNAP）的活性RNA聚合酶（RNAP）可以通过在单个重组大肠杆菌菌株中表达所有四个亚基来产生[1–3]。通过减少质粒数量和改变Banerjee等人[1]发表的共表达系统中Mtb基因的密码子用法，我们提出了一个简化、详细和可重复的含有ω亚单位的重组MtbRNAP纯化方案。此外，我们描述了三元延伸复合物（TEC）与短荧光标记的RNA引物和DNA寡核苷酸的形成，适用于转录延伸研究。纯化毫克数量的纯且高活性的全酶不需要硫酸铵或聚乙烯亚胺沉淀步骤[4]，只需要5 g湿电池。我们的结果表明，除α2ββ′ω·σA外，其他亚基组合可以通过Mono Q柱上的离子交换色谱分离，具有错误RNAP亚基化学计量比的组合缺乏转录活性。我们表明，MtbRNAP TEC可以通过NTP底物剥夺而停滞，并且可以在不需要任何辅助蛋白的情况下，通过添加缺失的NTP来追踪。最后，我们证明了纯化的MtbRNAP启动启动子转录的能力，并确定其开放启动子复合体由结核分枝杆菌蛋白CarD稳定。

总结虽然原核生物转录的基本机制是保守的，但很明显，一些细菌需要额外的因子才能进行有效的基因转录。CarD是一种RNA聚合酶（RNAP）结合蛋白，广泛存在于多种细菌中，对分枝杆菌至关重要。尽管CarD具有重要意义，但其在转录复合物中的功能尚不清楚。我们已经产生了一组突变，分别针对CarD的三个独立功能模块：RNAP相互作用域、DNA结合域和保守色氨酸残基。我们分析了每个功能模块在CarD活性中的作用，并建立了一个模型，其中每个模块都有助于稳定RNAP-启动子复合物。我们的工作强调了专性病原体结核分枝杆菌对所有三个CarD模块的要求，但对污渍分枝杆菌没有要求。我们还报道了CarD功能模块在抵抗氧化应激和色素沉着方面的不同用途。这些研究提供了有关CarD转录调控所涉及的功能域的新信息，同时也提高了对结核分枝杆菌生理学的理解。