DAP5分子MIF4G结构域的结晶及初步X射线衍射分析

肠病毒蛋白酶在感染期间裂解真核翻译起始因子4G（eIF4G）导致细胞cap依赖性翻译被阻断，但不影响含有内部核糖体进入位点（IRES）的mRNA的cap依赖型翻译的起始。死亡相关蛋白5（DAP5）是eIF4G的结构同源物，是含有IRES mRNA的翻译起始因子。柯萨奇病毒B3（CVB3）是一种阳性单链RNA病毒，是人类心肌炎的主要致病因子。其RNA基因组在5′-非翻译区内含有IRES，并通过帽非依赖性、IRES驱动的机制进行翻译。之前，我们已经证明DAP5在CVB3感染期间被裂解。然而，在CVB3感染期间，负责切割的蛋白酶、切割位点以及对目标基因翻译的影响尚未被研究。在本研究中，我们证明病毒蛋白酶2A而非3C负责DAP5的切割，分别产生45和52-kDa N-（DAP5-N）和C末端（DAP5-2C）片段。通过定点突变，我们发现DAP5在G434氨基酸处被裂解。在卵裂后，DAP5-N在感染的后期大部分转移到细胞核，而DAP5-C大部分留在细胞质中。这些DAP5截短物的过表达表明，与全长DAP5相比，DAP5-N保留了启动IRES驱动的凋亡相关p53翻译的能力，但不保留促生存Bcl-2（B细胞淋巴瘤2）的能力。同样，DAP5-N表达促进CVB3复制和子代释放；另一方面，DAP5-C对cap依赖性翻译起主导负向作用。总之，病毒蛋白酶2A介导的DAP5切割导致两个截短体的产生，这两个截短体对含有IRES的基因的蛋白质翻译产生不同的影响，导致宿主细胞死亡增加。柯萨奇病毒B3（CVB3）是病毒性心肌炎的主要病因，与猝死、扩张型心肌病和心力衰竭有关。2 CVB3基因组由一个开放阅读框组成，该阅读框被翻译成多蛋白，随后被病毒蛋白酶2A和3C处理。与其他小核糖核酸病毒类似，CVB3基因组与一个小病毒肽Vpg相连，而不是其5′末端的7-甲基鸟苷帽结构。因此，CVB3 RNA由cap依赖机制翻译，并由5′非翻译区（5′-UTR）内的内部核糖体进入位点（IRES）驱动。3,4病毒蛋白酶积极抑制多种宿主细胞活性，帮助病毒逃避宿主防御机制，促进病毒复制，促进宿主细胞凋亡。例如，肠道病毒蛋白酶可以裂解真核生物翻译起始因子4GI（eIF4GI）5-7和eIF4GII。据报道，8,9小RNA病毒蛋白酶也能裂解cap依赖型翻译起始复合体中的其他典型翻译起始因子，如eIF5B10和。。。

总结死亡相关蛋白5（DAP5/p97）是真核细胞起始因子4G（eIF4G）的同源物，可促进IRES驱动的多细胞mRNA翻译。其功能的核心是中间结构域（MIF4G），它募集RNA解旋酶eIF4A。eIF4G的中间域由串联HEAT重复序列组成，这些重复序列结合形成螺线管型结构。在这里，我们报告了DAP5 MIF4G结构域的晶体结构。它的整体折叠与eIF4G的折叠非常相似，然而，显著的构象变化赋予了不同的表面性质，这可以解释观察到的两种蛋白质之间IRES结合的差异。有趣的是，使用等温滴定量热法对DAP5-eIF4A相互作用进行定量分析显示，与eIF4G-eIF4A相互作用相比，亲和力低10倍，这似乎会影响它们在体外刺激eIF4A-RNA解舒活性的能力。复合体稳定性的差异可能对翻译起始模式的选择具有功能性影响。

脂质结合的小干扰RNA（siRNAs）在肝外组织中表现出积累和基因沉默，为将治疗性siRNA的效用扩展到肝脏以外提供了机会。化学工程脂质可以进一步改善siRNA的传递和疗效，但脂质结构/构型与siRNA药效学之间的关系尚不清楚。在这里，我们合成了一组单、双和三甲基脂肪酸结合的siRNA，以系统评估脂肪酸结构和价对siRNA清除、分布和功效的影响。脂肪酸价显著改变了共轭siRNA的物理化学性质，包括疏水性和胶束形成，从而影响其分布。三价脂结合的siRNA主要保留在注射部位，全身暴露最少，而一价脂结合siRNA则迅速释放到循环中，主要积聚在肾脏中。二价脂质结合的siRNA表现出中间行为，优先在肝脏中积累，并向肺、心脏和脂肪分配功能。共轭物的化学结构，而不是整体物理化学性质（即疏水性），预测了生产性基因沉默所需的肝外组织积累程度。我们的发现将为化学工程策略提供信息，以增强亲脂siRNAs的肝外传递。