反扩散法生长的晶体中0.94℃四方蛋清溶菌酶的结构

本文报道了人溶菌酶的全化学合成。溶菌酶在生物化学研究的各个领域，包括蛋白质折叠、酶催化和淀粉样蛋白生成，都是一个广泛的模型系统。人类酶的130-aa野生型多肽链由四个多肽段通过天然化学连接以完全收敛的方式组装而成。组装策略的关键是应用最近开发的动力学控制结扎方法，该方法可以有效控制两个肽硫酯的结扎，从而生成独特的产品。这一结果使得能够容易地制备64肽硫酯；该片段通过天然化学连接与66-aa-Cys肽相连，生成目标130-aa多肽链。如2D TOCSY NMR波谱所示，合成的多肽链在体外折叠成一个确定的三级结构，同时形成四个二硫化物。合成的人溶菌酶的结构通过高分辨率x射线衍射得到证实，得到了该酶迄今为止观察到的最高分辨率结构（1.04℃）。合成的溶菌酶产率高，纯度高，酶活性高。这种简便有效的聚合合成方案将使溶菌酶分子的独特化学类似物的制备成为可能，并将在未来溶菌酶研究的许多领域证明是有用的。溶菌酶可能是研究得最好的酶之一。1965年首次报道的鸡蛋白溶菌酶的x射线结构是酶分子的第一个高分辨率三维结构（1）。自那时以来，蛋白质一直是研究蛋白质折叠和错误折叠、酶催化和机理、x射线晶体学、酶进化和蛋白质工程的模型系统（2-9）。此外，人类溶菌酶最近引起了相当大的兴趣，因为该酶的某些突变被证明可以使蛋白质淀粉样变（10，11）。尽管在过去50年中进行了广泛的遗传、结构和物理化学研究，但关于溶菌酶折叠、催化和淀粉样纤维形成的许多问题仍未解决、解释不满意或有争议。这种缺陷至少部分归因于可用于改变溶菌酶分子化学结构的手段有限。为了在分子或原子尺度上详细了解蛋白质的性质，需要对酶的结构进行更强大和多功能的控制。在这方面，蛋白质化学合成已成为一种强有力的工具，特别是因为它几乎可以绝对控制酶分子的共价结构（12）（13）（14）。鉴于人们对溶菌酶研究的广泛而持久的兴趣，早在20世纪70年代（15、16）就设想（并尝试）化学合成全长蛋白质，这并不奇怪。然而，这些。。。

蛋清溶菌酶（HEWL）是研究蛋白质在表面和界面上吸附的一种广泛使用的样本。在这里，我们使用全原子分子动力学（MD）模拟、多参数表面等离子体共振（MP-SPR）、接触角和zeta电位测量来研究HEWL在二氧化硅表面的吸附。模拟提供了吸附机理的详细描述，并表明在pH7时，主要的吸附驱动力是静电，其次是较弱的疏水力。此外，它们揭示了吸附蛋白的择优取向，并表明其结构仅在与表面的界面处发生轻微改变。这为解释实验结果提供了基础，实验结果表明，表面在pH10左右吸附了一个封闭的单层，其中表面具有较大的负zeta电位，HEWL带正电荷。在较高的pH值下，由于蛋白质上的电荷损失，蛋白质层的吸附量大大减少。pH值较低时，表面zeta电位越小，HEWL吸附越低。这些解释得到了接触角测量的补充，该测量显示了当表面覆盖率最高时，表面的憎水性如何最大。模拟提供了被吸附的HEWL暴露于溶液中的疏水残基的详细信息，完成了蛋白质层结构的图片。

实时捕获蛋白质结构动力学在阐明生物功能和为基于结构的药物设计提供信息方面具有巨大潜力。虽然时间分辨结构测定长期以来被认为对绝大多数蛋白质靶点来说都是不可实现的，但结晶学的系列方法在促进此类分析方面具有巨大潜力。在这里，我们回顾了微流体技术对蛋白质晶体生长和X射线衍射分析的影响。特别是，我们专注于微流控技术在连续晶体学实验中的应用，用于蛋白质结构动力学的时间分辨测定。