噬菌体PP7的结构测定铜绿假单胞菌：从糟糕的数据到良好的地图

总结豇豆花叶病毒（CPMV）的空病毒样颗粒（eVLP）目前被用作各种生物医学和纳米技术应用的试剂。在这里，我们报告了使用2.3º分辨率的X射线晶体学测定的CPMV eVLP的晶体结构，并将其与之前报道的eVLP和病毒粒子晶体结构的低温电子显微镜（cryo-EM）进行了比较。虽然eVLP的X射线和低温电子显微镜结构基本相似，但在小（S）亚基的C末端存在显著差异。S亚基的完整C末端在CPMV病毒粒子和eVLP的有效组装中起着关键作用，但在颗粒形成后会发生蛋白水解。此外，我们报告了基于质谱的蛋白质组学分析结果，分析了来自CPMV eVLP的外壳蛋白亚基和识别S亚基C末端的病毒，这些病毒在多个位点进行蛋白水解裂解，而不是之前观察到的单一裂解位点。

PP7是一种产气假单胞菌的单链RNA噬菌体，与MS2和Q␤等大肠杆菌噬菌体有远亲关系。这里我们证明PP7外壳蛋白是一种特异的RNA结合蛋白，能够抑制融合到PP7复制酶翻译起始区的序列的翻译。其RNA结合活性是特异性的，因为它抑制PP7的翻译操作符，但不抑制MS2或Q␤噬菌体的操作符。确定了从分解的病毒样颗粒中纯化外壳蛋白并重建其RNA结合活性的条件。体外测定PP7操作员RNA的离解常数约为1 nM。利用外壳蛋白抑制复制酶-半乳糖苷酶融合蛋白翻译的遗传系统，鉴定了对PP7 RNA结合重要的氨基酸残基。几种单链RNA噬菌体的外壳蛋白是已知的翻译阻遏物。他们通过结合含有复制酶核糖体结合位点的RNA发夹来阻断病毒复制酶的合成。最近对RNA噬菌体的x射线结构测定表明，外壳蛋白氨基酸序列的比较显示出的同源性反映在它们的三级结构中（1-7）。外壳蛋白二聚体是病毒颗粒的阻遏物和基本构建块，由两个相互缠绕的单体组成，它们共同形成一个大的薄片表面，RNA在其上结合。每个外壳蛋白都使用一个共同的结构框架来结合不同的RNA，从而为研究特定RNA-蛋白识别的基础提供了机会。在之前的工作中，我们对MS2、GA和Q␤外壳蛋白（8-10）的RNA结合位点进行了表征。这里我们描述了PP7外壳蛋白的RNA结合特性，PP7是一种嗜气假单胞菌的RNA噬菌体，其外壳蛋白与MS2的氨基酸序列只有13%的同源性。我们提出以下发现。1） PP7的外壳蛋白是一种翻译阻遏物。2） 含有PP7复制酶翻译起始位点的RNA发夹在体内和体外都被PP7外壳蛋白特异性结合，表明该结构代表翻译算子。3）RNA结合位点位于外壳蛋白␤表。现提供该站点的地图。实验程序质粒构建Gordon Garde好心地向我们提供了在质粒上克隆的PP7外壳序列。我们使用聚合酶链反应和5个引物（5？-GGGTCTAGACGTACAGCGTACGGACTACTGAACGTAAG-3）扩增了外壳序列，该引物在外壳起始密码子上游引入了约40个核苷酸的XbaI位点，以及一个3引物（5-GGGG-ATCCATACCG-CAGGGCC-3）在终止密码子下游产生了一个BamHI位点。使用Pfu DNA聚合酶进行此扩增和随后的扩增。经XbaI和BamHI消化后，在pUC119（11。。。

金黄色葡萄球菌是皮肤和软组织感染（SSTIs）的主要原因，抗生素耐药性的增加需要创新的治疗策略。金黄色葡萄球菌使用分泌的环状自诱导肽（AIP）和辅助基因调节器（agr）操纵子来协调侵袭性感染所需的毒力因子的表达。在四个agr等位基因（agrⅠ-IV型和相应的AIPs1-4）中，agrⅠ型菌株最常与侵袭性感染相关。通过硫代内酯键进行环化对AIP功能至关重要；因此，识别AIP1的环状可能是抗体介导中和所必需的。然而，AIP的小尺寸和不稳定的硫内酯键阻碍了疫苗的开发。为了克服这一点，我们使用病毒样颗粒（VLP）疫苗平台（PP7）对修饰的AIP1氨基酸序列（AIP1S）进行构象限制呈递。接种PP7-AIP1S可诱导AIP1特异性抗体并限制体内agr激活。重要的是，与对照组相比，在具有高毒力agr I型金黄色葡萄球菌分离物的小鼠SSTI挑战模型中，PP7-AIP1S疫苗接种降低了发病率并增加了细菌清除率，证明了疫苗的有效性。鉴于MRSA agr I型菌株对人类疾病的贡献，以AIP1调节毒力为靶点的疫苗在对抗抗生素耐药性方面可能具有重大的临床影响。