SOX4通过调节TCR信号控制NKT细胞的恒定分化

免疫系统的淋巴细胞大致分为快速反应的先天性（或感染数小时内的先天性）和慢反应的（数天内）适应性细胞系。表达由重组激活基因（RAG）重组酶产生的克隆抗原受体的淋巴细胞通常被归类为适应性免疫细胞。然而，先天性B1细胞的活动和起源有根本不同(赫森伯格和赫森伯格，1989年)γδTCR胸腺编程⁺和αβTCR⁺胸腺细胞在进入外周组织之前变成离散的功能效应器(Ribot等人，2009年;Narayan等人，2012年;Lee等人，2013年)TCR-阴性固有淋巴细胞（ILC）与T细胞亚群具有相似的效应器功能，这些发现强调了克隆抗原受体表达不足是免疫细胞类型的定义特征。相反，定义基因网络的效应子集的建立时间（在病原体暴露之前或之后）被提出为淋巴细胞亚群分类的更具凝聚力的参数(Kang和Malhotra，2015年).

γδT细胞，CD8α⁺，上皮内T细胞，TCRαβ⁺不变自然杀伤T（iNKT）细胞和粘膜相关不变T（MAIT）细胞是表达TCR的四种主要胸腺细胞类型，但仍表现出显著的先天免疫细胞特征。每种细胞类型的效应器亚群在胸腺中分化，然后输出到周围组织。与CD4形成的γδT细胞不同⁻CD8（CD8）⁻双阴性（DN）胸腺前体细胞、iNKT和MAIT细胞主要来自未成熟CD4⁺CD8（CD8）⁺双阳性（DP）胸腺细胞能有效地重新排列克隆型Tcra公司基因(Godfrey等人，2010年;Koay等人，2016年). 然而，DN胸腺细胞可产生肝嗜性iNKT亚群(Dashtsoodol等人，2017年). 最常见和研究最深入的类先天性小鼠αβT细胞是iNKT细胞，其特征是表达不变的Vα14-Jα18 TCR链(Godfrey等人，2010年;Engel等人，2016年). iNKT细胞识别与MHC I类分子CD1d相关的脂质。直到最近，NKT细胞的发育主要是通过探测0-3期（以CD24、CD44和NK1.1标记的使用为特征）的表型限制的序列成熟中间产物来研究的。3期NKT细胞仅产生Th1细胞因子，因此称为NKT1，而1期和2期包含IL-4和IL-17（Th2-和Th17-like）的异质池，分别产生NKT2和NKT17细胞(Lee等人，2013年).

基于转录因子（TFs）的胸腺NKT效应器的新设计分离构建了一个新的视角来推断胸腺内NKT细胞分化中的分子事件。以前，一些已知的常规αβT细胞发育所需的TF也被证明是胸腺iNKT成熟期不同阶段进展所必需的。例如，RORγt通过其延长DP细胞存活时间和允许Vα14 TCR基因重排的能力介导NKT细胞的发育(郭等，2002). 其他各种调节DP细胞信号传导、选择或存活的TF，如E-box家族成员HEB、EGR2、RUNX1和c-MYC，也被证明参与iNKT细胞的生成(D’Cruz等人，2010年;Godfrey等人，2010年). 胸腺中Akin对γδT效应子集的编程(Narayan等人，2012年)，iNKT胸腺亚群根据T-bet的不同TF活性进行分离(Tbx21塔布)、PLZF(Zbtb16号机组)和RORγt(Rorc公司)，分别指导NKT1、NKT2和NKT17子集规范(Lee等人，2013年). 这些结果表明，无论表达何种抗原受体类型，类先天性T细胞亚型的发育通常由基因调控电路引导，以编程先天性属性。然而，TCR信号强度与选择性iNKT效应器分化有关(Lee等人，2013年;Cruz Tleugabulova等人，2016年)因此，γδTCR和αβTCR都有可能传递类似的细胞命运指示信号来编程胸腺内固有T细胞亚群。

为了确定iNKT细胞是否受TCR信号非依赖性TF的调节，我们重点研究了高迁移率组（HMG）盒TF。我们发现，HMG盒TFs SOX4和SOX13是先天性真皮γδT细胞胸腺发育所必需的，该细胞可产生IL-17（Tγδ17；Malhotra等人，2013年). 这里，我们表明SOX4对iNKT和MAIT细胞的发育也是必要的，但似乎不影响适应性αβT细胞分化。SOX4调节MicroRNA-181的表达(米尔181)调节TCR信号的DP胸腺细胞家族成员(Li等人，2007年). SOX13也控制iNKT细胞的生成，但其影响主要是NKT17细胞，反映了SOX13在Tγδ17细胞生成中不可或缺的功能(Malhotra等人，2013年). 因此，αβ和γδ先天性T细胞的发育依赖于HMG盒TF网络，支持T细胞的共享属性，这取决于效应器功能的胸腺编程，而不是TCR类型本身。

Sox4系统^−/−小鼠胚胎致死(Schilham等人，1996年,1997). SOX4是干细胞分化的调节器(Sinner等人，2007年;Novershtern等人，2011年)、和Sox4系统^−/−胎儿肝干细胞在T细胞和B细胞生成中受损(Schilham等人，1996年,1997). 在胸腺中，索克斯4DN胸腺前体细胞表达最高。未成熟（CD24⁺)常规αβTCR⁺胸腺细胞（CD4⁺CD8（CD8）⁺DP）和表达γδTCR的未成熟固有胸腺细胞以及注定成为不变Vα14 TCR的胸腺细胞⁺NKT细胞也表达Sox4系统(Narayan等人，2012年;Cohen等人，2013年;2018年免疫基因组项目联盟). 过渡到成熟状态时（CD24^否定)，该表达在γδTCR中消失⁺和iNKT细胞，在常规CD4或CD8单阳性胸腺细胞中减少(2018年免疫基因组项目联盟). 为了测定胸腺内αβT细胞发育过程中SOX4的功能，我们培育了Sox4系统将老鼠“漂浮”到Cd2号机组-Cre，抄送4-Cre和Rorc公司-Cre小鼠，因此从胸腺DN或DP前体细胞发育而来的所有NKT细胞都经历了Cre介导的重组（图S1 A和数据未显示），并且缺乏Sox4系统成绩单（数据未显示）。我们将这些小鼠称为T细胞限制性Sox4系统-零等位基因变体（T-Sox4系统^−/−; 图中条件基因敲除（CKO）。我们之前发现Tγδ17细胞依赖于Sox4系统用于开发(Malhotra等人，2013年)，而函数Sox4系统αβT细胞的发育尚未详细确定。常规T细胞前体亚群（DN亚群1-4）、DP、单个阳性T细胞和FOXP3的比例和细胞数⁺调节性T细胞在缺乏Sox4系统（图S1 B和数据未显示）。然而，αβiNKT细胞的发育在缺乏Sox4系统在外周组织中也观察到缺乏iNKT细胞，尤其是LN和肝脏，在那里通常有大量NKT淋巴细胞(图1、A和B). NFIL3依赖性脂肪iNKT细胞的频率(Lynch等人，2015年)T值减少-Sox4系统^−/−，但差异没有统计学意义（图S1 C）。观察到类似的iNKT细胞发育缺陷抄送4-Cre；T型-Sox4系统^−/−小鼠，表明SOX4主要需要在胸腺细胞分化的DP阶段（数据未显示）。数据生成自镉2-Cre小鼠将作为代表T-Sox4系统^−/−老鼠。

我们还评估了与iNKT细胞相关的其他先天性淋巴效应亚群的发展。CD1d限制但“多样”的2型NKT细胞，被鉴定为TCRβ⁺NK1.1标准⁺CD1d-PBS57型^负胸腺和脾脏中的细胞也减少，但T的LN没有减少-Sox4系统^−/−小鼠与WT对照组进行比较（图S1 D）。γδTCR⁺（Vγ1.1）⁺Vδ6.3⁺)NKT细胞和Vα18⁺MAIT细胞是小鼠中另外两个依赖PLZF的固有T细胞亚群(科瓦洛夫斯基等人，2008年;Savage等人，2008年;Narayan等人，2012年;Pereira和Boucontet，2012年). γδNKT细胞的TCR配体未知，而MAIT细胞在非经典MHC I类分子MR1的背景下识别维生素代谢物(Kjer-Nielsen等人，2012年). 而SOX4对γδNKT细胞的发育和/或维持来说不是必需的(图1 C)在大多数组织中MAIT细胞的生成都需要它，在这些组织中观察到MAIT细胞数量减少了两到四倍(图2 A). 在没有SOX4的残留MAIT细胞中，表型分析显示没有实质性改变。在皮肤以外的组织中，CD4适度过度表达⁺和CD8⁺WT小鼠、LN和胸腺中“未激活”CD44主要DN亚群的亚群^否定细胞数增加(图2 B). 这些结果表明，SOX4控制多个先天性T细胞亚群的发育，而对适应性αβT细胞的产生没有明显影响。

为了确定在iNKT细胞分化过程中SOX4何时发挥其功能，我们评估了T-Sox4系统^−/−通过追踪成熟标记物和iNKT效应器亚群特异性TF的小鼠。在新生儿中，当iNKT细胞首次出现时(Gapin等人，2001年)、残差Sox4系统-缺乏型iNKT细胞按比例富集最不成熟的（CD24⁺)iNKT细胞（DP，CD1d-PBS-四聚体⁺CD24型⁺; 重量，0.3±0.2%vs.CKO，2.5±0.8%；指±SEM；n个=5/基因型；图3 A). 然而，这些早期iNKT亚群的数量没有显著差异，这表明从DP阶段向iNKT细胞成熟的后续阶段过渡需要SOX4。随着小鼠年龄的增长，T细胞中残留的iNKT细胞-索克斯4^−/−小鼠（范围：～12–20%的WT小鼠）表现出成熟中间产物的相对正常分布(图3 B和图S2 A），与WT小鼠相比增殖略有增强（图S2 B）。然而，Sox4系统-缺乏胸腺和外周iNKT细胞在IL-4生成中受损(图3 C). 在T的胸腺中-Sox4系统^−/−小鼠，IFNγ缺陷更明显⁺白介素-4⁺双产生细胞，而在外周则缺乏所有产生IL-4的细胞。Sox4系统-iNKT细胞缺陷使胸腺和脾脏保持产生IFNγ的能力。然而，LN iNKT细胞在产生IFNγ方面存在缺陷，这与T-bet表达的改变有关（如下）。

确定残留物的功能缺陷Sox4系统-iNKT细胞缺乏可归因于直接产生效应细胞因子的TFs表达受损，我们评估了PLZF、GATA3、T-bet和RORγT在Sox4系统-iNKT细胞缺乏。从胸腺开始，这些效应器功能编程TF可用于识别不同的效应器亚型(Lee等人，2013年;Engel等人，2016年). 研究表明，iNKT细胞产生的IL-4受三种TF调节：PLZF、GATA3和cMAF(Godfrey等人，2010年). 三种TF在T细胞残留iNKT细胞中的表达没有显著改变-Sox4系统^−/−老鼠(图3 D以及未显示的数据），表明在缺乏Sox4系统不可归因于已知监管机构表达的变化。此外，对iNKT细胞内稳态起重要作用的细胞因子受体，即IL-2、IL-7和IL-15的表达，在T细胞内残留的外周iNKT细胞中并没有显著且持续的改变-Sox4系统^−/−尽管在选定的淋巴组织中观察到一些变异（图S2 C），但表明细胞因子介导的iNKT细胞维持不太可能解释效应器编程的外周iNKT细胞的缺陷。鉴于SOX4在功能上与控制2型细胞因子产生的蛋白质相互作用(Kuwahara等人，2012年)这些和其他未记录的相互作用的丧失可能是产生效应细胞因子能力改变的基础。

另一个引人注目的变化是Sox4系统-iNKT亚群缺陷导致T-bet下降⁺在所有检查组织中观察到的NKT1细胞(图3、D和E). 在胸腺中，T-bet的比率⁺（NKT1）：GATA3⁺（NKT2）NKT细胞在T-Sox4系统^−/−而在对照组小鼠中，NKT1细胞持续增多(图3 D). GATA3协议⁺iNKT细胞通常为PLZF^你好这种模式在T-Sox4系统^−/−胸腺残余iNKT细胞（数据未显示）。与外周血LN-iNKT细胞产生IFNγ的能力受损一致(图3 C)，剩余T形支架的减少⁺LNs中可见iNKT细胞，RORγt的相互增强⁺NKT17细胞(图3E). 剩余T-bet内⁺NKT1人群，干扰素γ的频率⁺WT和T细胞相似-Sox4系统^−/−小鼠（图S2 D）。RORγt对IL-17A的产生也观察到类似的结果⁺NKT17细胞，而IL-4的产生在CD24中减少了大约两倍^–NK1.1标准^–iNKT细胞，包含NKT2细胞。此外，超过一半的T-bet⁺PLZF公司^洛iNKT细胞正常表达CD4，但Sox4系统-T-bet不足⁺对应物的CD4特异性耗尽⁺子集(图3 F). 这些结果建立了以下层次结构索克斯4iNKT亚群之间的依赖性：NKT1>NKT2>NKT17>脂肪iNKT。

最近有研究表明，TCF1和LEF1在iNKT细胞分化过程中也介导中枢功能，它们是常规αβT细胞发育所必需的。虽然两种TF的突变都抑制了iNKT细胞的生成，其程度与T-Sox4系统^−/−小鼠、TCF1和LEF1分别对NKT2/17和NKT2细胞有更明显的影响(Carr等人，2015年). T型-索克斯4^−/−小鼠在DP胸腺细胞或iNKT细胞亚群中未表现出TCF1和LEF1表达的改变（图S2 E）。复合突变Sox4系统和七氟化碳与Sox4缺乏小鼠相比，iNKT细胞耗竭更为严重（图S2 F），但由于在七氟化碳^−/−老鼠。然而，与T不同-Sox4系统^−/−iNKT细胞，双缺陷小鼠残留iNKT细胞累积NK1.1⁺CD44细胞⁻以NK1.1为代价的电池⁺CD44细胞⁺细胞（图S2 G），表明TCF1可以执行不同于SOX4的功能。总之，这些结果表明三种HMG-TF（SOX4、TCF1和LEF1）在iNKT细胞发育中调节非冗余功能，分别促进数值正常输出和调节NKT子集特定编程。

接下来，我们评估了缺乏SOX4的iNKT细胞数量和功能编程缺陷是否也会导致体内对同源iNKT细胞TCR配体α-半乳糖神经酰胺（αGC）的反应不足。T型-Sox4系统^−/−和窝友对照组注射αGC，并分析各种iNKT细胞依赖性过程。αGC注射后数小时内，iNKT细胞被激活产生细胞因子；αGC给药后2 h，WT-iNKT细胞强烈产生IFNγ和IL-4，而T细胞产生细胞因子-Sox4系统^−/−iNKT细胞显著减少（图S3 A）。αGC对iNKT细胞的初始激活导致NK细胞的“反式激活”(Carnaud等人，1999年); 与iNKT细胞细胞因子产生的早期缺陷一致，通过IFNγ产生和CD69上调评估，NK细胞反式激活在T细胞中显著降低-Sox4系统^−/−小鼠与WT小鼠的比较（图S3 B）。在最初激活后，iNKT细胞下调表面TCR，随后TCR急剧扩张和重新表达。当比较来自αGC注射的WT和T细胞的iNKT细胞时，TCR的早期下调（通过CD1d-PBS57染色评估）类似-Sox4系统^−/−小鼠（图S3 C），并且我们在WT或T中都没有观察到iNKT细胞的显著细胞死亡-Sox4系统^−/−αGC注射后的小鼠（图S3 D）。有趣的是，αGC注射3天后，T-Sox4系统^−/−iNKT细胞以类似于αGC注射的同窝对照的iNKT细胞的方式强烈扩增（图S3 E）。这些数据共同表明，SOX4控制初始iNKT细胞群大小(图1)和效应器功能，但不是外周iNKT细胞在被强同源配体激活后的增殖反应。

DP-DP细胞相互作用产生iNKT细胞和Sox4系统在DP胸腺细胞中高表达，但在大多数iNKT细胞中表达量减少(Engel等人，2016年;Lee等人，2016年;2018年免疫基因组项目联盟)，表明iNKT细胞发育的初始SOX4依赖性编程发生在DP细胞中。因此，要追溯T细胞iNKT缺陷的起源-Sox4系统^−/−我们首先确定了小鼠在Sox4系统-DP胸腺细胞缺陷。胸腺细胞存活率-Sox4系统^−/−小鼠与WT小鼠相同（图S4 A）和Vα14-Jα18 TCR基因重排，这是罕见的，需要正常的DP细胞存活(郭等，2002)，没有改变（图S4 B），表明T细胞中iNKT细胞的缺陷-Sox4系统^−/−小鼠与Vα14-Jα18重组事件发生率降低无关。转录组的全球差异也受到限制，但可以确定一些受SOX4直接或间接控制的候选分子(图4 A). DP胸腺细胞上两种细胞表面分子CD24和CD1d的表达在Sox4系统-缺陷的DP细胞（图S4 C）和阵列数据表明存在显著差异，在转录水平上不符合折叠变化标准。HMG盒TF被建议用于控制细胞系中CD24和CD1d的表达(Shulewitz等人，2006年;Chen等人，2010年)，但TCF1和LEF1不影响胸腺细胞上CD24或CD1d的表达(Carr等人，2015年以及未显示的数据），增加了SOX4在体内发挥更重要作用的可能性。抗体（Ab）介导的WT小鼠CD24阻断(Askew和Harding，2008年)没有导致iNKT细胞分化的改变（数据未显示），这表明CD24表达的减少不可能解释T细胞iNKT发育阻滞-Sox4系统^−/−老鼠。

CD1d表达的改变Sox4系统-胸腺细胞缺陷增加了iNKT细胞发育缺陷可能是由于TCR激动剂CD1d复合物可用性降低所致。为了测试这一点，我们产生了由先天性标记的WT和T组成的混合骨髓（BM）嵌合体-Sox4系统^−/−BM细胞（CD45.1的1:1比率⁺重量：CD45.2⁺T型-Sox4系统^−/−)这样的话Sox4系统-缺乏的胸腺细胞可以在WT-DP胸腺细胞上获得正常CD1d。如果突变DP细胞CD1d表达减少是iNKT细胞生成受损的根本原因，那么混合嵌合体小鼠iNKT细胞发育的缺陷应该得到恢复。与T中相同-Sox4系统^−/−小鼠iNKT细胞不能从混合BM嵌合体中的突变前体有效发育(图4 B; WT，0.5±0.1%的iNKT细胞；CKO，0.04±0.02%，n个= 12). 少数iNKT细胞从Sox4系统-缺乏前体细胞的胸腺iNKT亚群与WT前体细胞分布相对相似(图4 B). 这些结果表明，存在WT-DP胸腺细胞和正常数量的CD1d不能拯救Sox4系统-CKO小鼠iNKT细胞生成缺陷和iNKT缺陷是由细胞内在缺陷引起的Sox4系统-缺乏iNKT前体。

TCRβ链全谱分析表明，在T细胞LNs中发现的少数iNKT细胞-Sox4系统^−/−小鼠与WT-iNKT细胞相当（图S4 D）。剩余的Sox4系统-然而，缺陷的胸腺NKT1细胞始终表达最低量的CD5，这是TCR信号强度的代用品(Azzam等人，1998年)，与WT对照组相比（图S4 E）。这增加了SOX4调节NKT1细胞发育的TCR信号的可能性。与此一致，Sox4系统-缺乏的DP胸腺细胞在钙中受损²⁺钙降低所指示的信号²⁺TCR体外交联通量(图5 A). Ca的表达减少²⁺-调节NFAT靶基因第二阶段在里面Sox4系统-缺陷的DP胸腺细胞（图S4 F）进一步支持了iNKT细胞在T细胞中丢失的可能性-Sox4系统^−/−与TCR信号异常有关。缺乏STIM1和STIM2的小鼠，它们控制着储存的钙²⁺条目，以及第二阶段-缺陷小鼠在iNKT发育中也表现出选择性缺陷，因为这些突变体中的传统T细胞生成基本上是完整的(Lazarevic等人，2009年;Oh-hora等人，2013年).

上述TCR信号代用品的流式细胞术分析在历史上受到非常有限的信号分离的影响，因此需要对SOX4介导的TCR信号控制提供额外的实验支持。为了确定TCR信号受损的小鼠是否表现出与T细胞相似的缺陷-Sox4系统^−/−我们分析了CD3ζ链（TCR的一种专用信号传感器）信号缺陷小鼠的iNKT亚群发育。在这些小鼠中（6F:247加元^6楼/6楼)CD3ζ的6个内源性ITAM中的酪氨酸磷酸化位点被苯丙氨酸（F）取代，使其无法进行信号转导，CD3复合物信号容量降低～60%（CD3ε和CD3δ贡献了4个ITAM；Hwang等人，2012年). 6F小鼠在常规αβT细胞发育中有相对轻微的扰动，但与T细胞相似-Sox4系统^−/−小鼠产生选定的先天性T细胞亚群，包括Tγδ17细胞(Spidale等人，2018年)，受到损害。6F小鼠胸腺和LN中iNKT细胞的频率略有增加，但并未转化为细胞数的显著差异（数据未显示），但NKT1（NK1.1⁺CD44细胞⁺或T-bet⁺)亚群的代表性很低，IFNγ的产生减少(图5 B). 虽然NKT1细胞缺陷在T细胞中更严重-Sox4系统^−/−小鼠，在6F小鼠中观察到的NKT1细胞的特异性缺陷支持了TCR信号传导能力的降低Sox4系统-缺乏DP胸腺细胞作为iNKT细胞发育阻滞的一种成分。

先天性T细胞对TCR信号装置的选择性要求与发育需要突破的较高信号阈值有关。全球转录组分析表明miR181在Sox4系统-DP胸腺细胞缺陷(图4 A)实时定量PCR检测证实了这一发现(图6 A).和平号181a/b-1已证明是TCR信号和Ca的正向调节器²⁺通量和小鼠缺乏米尔181a/b-1iNKT细胞发育有特定缺陷，常规αβT细胞发育基本正常，与T细胞相似-Sox4系统^−/−老鼠(Henao-Meja等人，2013年;Ziętara等人，2013年). 有趣的是，Sox4系统据报道，在和平号181a/b-1–与WT对照组相比，DP胸腺细胞缺乏(Henao-Meja等人，2013年). SOX4可以直接控制米尔181a/b-1利用单克隆抗体对SOX4进行染色质免疫沉淀（ChIP）分析，结果表明SOX4与米尔181a/b-1位于转录起始位点附近HMG盒共识基序的DP胸腺细胞(图6 B). 此外，使用抗组蛋白ChIP、组蛋白3甲基化模式米尔181a/b-1WT-DP胸腺细胞中的位点显示活性染色质标记（H3K4me3）富集，而T-Sox4系统^−/−DP胸腺细胞抑制标记（H3K27me3）占主导地位(图6 B). 这些结果与SOX4作为TF施加的转录许可染色质状态一致米尔181基因。

确定是否减少米尔181a-1中的表达式Sox4系统-缺乏胸腺细胞是iNKT细胞发育障碍的部分原因，我们评估了逆转录病毒的能力米尔181a/b-1表达Sox4系统-缺乏BM祖细胞以在BM嵌合体中生成iNKT细胞。逆转录病毒转导的细胞通过GFP报告基因表达进行标记。逆转录病毒转导的iNKT细胞Sox4系统-缺陷祖细胞产生的iNKT细胞频率与野生型祖细胞相似(图6、C和D). 已强制执行米尔181a/b-1表达恢复了NKT细胞的正常发育Sox4系统-缺乏祖细胞，包括NKT亚群的正态分布（数据未显示）。这些结果将SOX4定位为米尔181a/b-1调制TCR信号通路(Henao-Meja等人，2013年;ZiÉtara等人，2013年)以及SOX4调节米尔181a/b-1表达对NKT细胞的正常发育至关重要。考虑到Sox4系统和米尔181缺乏DP胸腺细胞米尔181a/b-1和Sox4系统分别为(Henao-Meja等人，2013年)，它们被建模为在正反馈回路中运行，以设置TCR信号阈值。

四个HMG盒TF、SOX4、SOX13、LEF1和TCF1控制Tγδ17细胞分化(Malhotra等人，2013年)、和Sox4系统,勒夫1、和七氟化碳现已证明对iNKT细胞生成至关重要。我们接下来调查了索氏13也参与了iNKT细胞的发育。在造血细胞中，SOX13被确定为第一个在γδ与αβT细胞系发育中明确表达的TF，在γδTCR中活跃⁺胸腺细胞，但在常规αβTCR中缺失⁺单元格(Melichar等人，2007年). 然而，ECFP记者受到索氏13小鼠iNKT细胞发育早期的启动子(Spidale等人，2018年). 我们用抗GFP细胞内染色证实了这一结果，这进一步表明，在胸腺中，约30%的RORγt⁺iNKT细胞表达Sox13系列启动子驱动的报告子，RORγt表达减少^否定iNKT细胞（图S5、A和B）。此代理用于Sox13系列表达模式得到了分类iNKT细胞亚群的全局转录组分析的支持(Cohen等人，2013年)通过iNKT细胞的单细胞转录组分析，这表明Sox13系列单个NKT17细胞亚群中的转录(Engel等人，2016年).

Sox13系列^−/−（129/J）小鼠胸腺中iNKT细胞总数减少约两倍(图7，A和B)，但LN中的数量平衡。鉴于SOX13建立了Tγδ17细胞的基因网络，NKT17细胞也有类似的作用。公布的NKT单细胞转录组数据的重点分析(Engel等人，2016年)Tγδ17细胞基因特征的表达，如黑色，疤痕2(5830411N06瑞克)，问题3,凸轮2d,Gpr183型、和Sox13系列，揭示了Tγδ17和NKT17细胞之间的强烈重叠（图S5 C）。Sox13系列^−/−小鼠胸腺中NKT17或RORγt的表达没有偏向性缺陷，但RORγt的数量减少了两倍⁺外周淋巴结中的NKT17细胞(图7，A和B)以及皮肤（数据未显示）和LN-iNKT细胞中IL-17生成的伴随减少(图7 C). 与T细胞中残留NKT1细胞产生IFNγ的情况类似-索克斯4^−/−小鼠（图S2 D），剩余RORγt产生IL-17A⁺NKT17细胞Sox13系列^−/−小鼠与对照组相当(图7 D). 结合以下表达式Sox13系列在胸腺中发育iNKT17细胞，但不是胸腺外发育(2018年免疫基因组项目联盟; 数据未显示），结果表明IL-17A的频率降低⁺iNKT细胞来源于胸腺。而iNKT细胞在缺乏Sox13系列，只产生IL-4的细胞数量减少了两倍(图7 C). 此部分效应器子类型依赖于Sox13系列在先天性αβT细胞亚群中可能对iNKT细胞特异，因为Sox13系列^−/−小鼠（数据未显示）。这些结果表明，一些NKT17细胞编程表达Sox13系列可能不会在胸腺外组织中繁殖或扩张。因此，两种先天性T细胞谱系αβTCR的发育⁺iNKT细胞和γδT细胞亚群的特点是对HMG盒TF四分之一有共同的需求，但T细胞谱系中四分之一的基因调控域仅部分重叠，表现出相当大的谱系特异性。

虽然TCR-依赖性选择后驱动胸腺内iNKT和MAIT细胞的TF网络具有很好的特征，但对于DP胸腺细胞中的TF，其指导先天性αβT细胞的分化，尤其是那些不影响常规αβT淋巴细胞发育的TF知之甚少。RORγt和RUNX1已被确定为从DP细胞生成iNKT细胞所需的最早TF(郭等，2002;Egawa等人，2005年;Thapa等人，2017年). 此处的数据表明Sox4系统在DP细胞中也起调节iNKT细胞发育的作用，部分通过控制米尔181表达和调节TCR信号。与大多数NKT效应器谱系决定TF不同，Sox4系统DP胸腺细胞中的表达相对较高，CD1d四聚体中的表达严重下调⁺CD24型^否定电池（图S5 C；Engel等人，2016年;2018年免疫基因组项目联盟)，在效应器获取阶段支持其主要功能。

最近的研究(Narayan等人，2012年;Cohen等人，2013年;Jojic等人，2013年;Yin等人，2013年)已经证实，iNKT细胞在转录体中与天然NK和γδT细胞的关系和功能比与常规αβT细胞更密切。本文阐述的HMG盒TF与γδT细胞的共同操作域可以部分解释基因表达水平上的谱系相关性。然而，这种相关性的机械基础仍有待确定。在其最简化的模型中，该机制与TCR的指导功能相关联，以指定T细胞谱系选择。迄今为止，大多数关于iNKT细胞的发育研究都集中于传统T细胞发育中发现的基因网络。鉴于不变TCR介导的iNKT细胞胸腺内选择的重要性，这是一个自然的进展。大多数分子确定阻断iNKT成熟与强TCR信号有关（例如CD3成分、ZAP70、ITK[Arase等人，1995年;Iwabuchi等人，2001年;Felices和Berg，2008年]和EGR2[Lazarevic等人，2009年])或介导DP-DP细胞相互作用的辅助分子（例如SLAM-SAP；Griewank等人，2007年). 因此，iNKT细胞先天性淋巴特性的获得与独特的TCR介导的阳性选择有关。将PLZF确定为TCR、iNKT和MAIT效应细胞因子特征之间的必要中继(科瓦洛夫斯基等人，2008年;Savage等人，2008年)TCR驱动的谱系分化与TF的诱导相耦合，TF可以发挥先天性淋巴细胞的功能。

然而，PLZF的表达倾向于在小鼠胎儿至新生儿阶段产生的祖细胞，这些祖细胞表达林28b(Yuan等人，2012年). 这种MicroRNAs调节因子仅在胎儿造血祖细胞中表达，并负责启动PLZF和其他与先天性淋巴细胞功能相关的分子。此外，T细胞谱系规范HMG TF TCF1(韦伯等人，2011年)压抑Zbtb16号机组转录和PLZF⁺TCR公司^负胸腺前体确实存在（数据未显示），进一步支持了Zbtb16号机组TCR信号本身的表达。PLZF选择性地表达在γδTCR的子集中⁺表达近典型受体（Vγ1.1）的NKT细胞⁺Vδ6.3⁺)与αβiNKT细胞共享重叠功能和全局基因表达谱(Felices等人，2009年;Kreslavsky等人，2009年;Narayan等人，2012年;Cohen等人，2013年). 考虑到亚群之间的总体相似性，可以预测NKTγδTCR和αβTCR信号的质量是收敛的，如果TCR信号主要决定细胞谱系的选择。然而，亚群的TCR信号要求是两极的：αβiNKT细胞缺失或减少247加元（CD3ζ）^−/−,Fyn公司⁻、和Itk公司^−/−小鼠，但γδNKT细胞在突变体中数量增加(Arase等人，1995年;Gadue等人，1999年;Felices和Berg，2008年;Felices等人，2009年; Yin，C.，个人沟通）或与WT相比没有改变。同样，Sox4系统或米尔181缺乏损害αβiNKT，但不损害γδNKT细胞分化(Sandrock等人，2015年). 尽管这些分子中的一些（例如FYN）可能并不完全传递TCR信号，但这些结果与PLZF的“收敛TCR信号”模型不兼容⁺从前体细胞分化为先天性T细胞。

先天性T细胞发育的另一种机制模型提出，不同的指导性输入导致收敛性输出，从而不同的细胞外部线索可以打开特定的T细胞效应器基因电路。例如，不同的TCR信号质量和/或数量可以被纳入定义T细胞效应器亚型的TF的开/关状态，但如果潜在基因电路在不同的T细胞类型中已经处于不同的基本设定点，则一个信号输入（例如TCR）可以被其他输入（例如细胞因子）替代。Tγδ17基因程序可能代表预连线基因程序决定胸腺中T细胞谱系规范的一端，而传统的适应性T细胞发育位于另一端，TCR信号是最终的仲裁者。在这种方案中，iNKT细胞可能更接近中间，在中间，以HMG-TF为中心的基因程序偏向细胞的效应器命运，但TF的活性与TCR信号传导相结合。这种集成的一个结果是，共享核心TF网络在不同的单元类型中的操作不同。例如，SOX4对于Rorc公司在DP细胞或NKT17细胞中转录，而它对Rorc公司γδT细胞的转录(Malhotra等人，2013年). 相反，SOX4抑制Th2细胞分化(Kuwahara等人，2012年)而SOX4是iNKT细胞产生IL-4所必需的。

SOX4是一种独特的TF，可以通过诱导米尔181a/b-1以及控制iNKT细胞选择所必需的其他基因（例如。，Cd1d号)在DP单元中。米尔181以前已经证明可以增强DP细胞中的TCR信号，其种系缺失对iNKT细胞的发育有害(Li等人，2007年;Henao-Meja等人，2013年;Ziętara等人，2013年). 这是一个缺陷米尔181以T表示-Sox4系统^−/−小鼠在常规αβT细胞选择中不会导致明显的改变，这可以通过两个不同的过程来解释。在传统的适应性T细胞开发中，TCR储备的广泛性可能会容忍TCR信号能力的改变，而iNKT的受限储备则无法实现相同的补偿。或者，iNKT细胞可能主要来自随机表达最高水平SOX4和Mir181的DP细胞。DP细胞之间先前存在的克隆异质性的概念，以及TCR信号敏感性中伴随的细胞内在变异，使某些DP细胞偏向特定效应子类型，将使用Sox4系统我们产生的报告鼠。

除了NKT细胞和γδT细胞的整体相关性外，Tγδ17和NKT17细胞之间的基因表达特征也有显著的保守性，包括诸如Sox13系列,黑色以及之前被认为是γδT细胞谱系受限的Scart2。虽然支持NKT细胞胸腺选择的T–T相互作用模拟预先编程的Tγδ17细胞分化的某些方面的可能性不能被正式排除，但我们最近发现，存在一个专门的、TCR信号独立的祖细胞亚群，导致Tγδ17-细胞的产生(Spidale等人，2018年). 因此，与其他来源于DP细胞的NKT细胞相比，一些NKT17细胞可能来源于不同的前体细胞类型。最近，研究表明，iNKT细胞存在DN前体，这些DN前体是嗜肝细胞并产生IFNγ(Dashtsoodol等人，2017年). 因此，先天性iNKT细胞亚群的发育起源可能比目前所了解的更为复杂，部分原因是与传统适应性T细胞不同的特定遗传需求。

Sox4系统^{飞行/飞行},七氟化碳⁻/⁻、和247加元^6f/6f（所有C57BL/6背景）小鼠如前所述(Hwang等人，2012年;Malhotra等人，2013年).Rorc公司-Cre和抹布1^−/−这些老鼠是从杰克逊实验室购买的。Sox13系列启动子–ECFP“敲入”小鼠在家中产生，其特征包括在Spidale等人（2018）小鼠通常在4-6周时进行胸腺发育研究，在8-12周时进行外周iNKT细胞持续性和功能分析。在一个实验中，老鼠的年龄和性别总是匹配的。所有实验均由马萨诸塞大学医学院动物护理和使用委员会批准。

从BD Biosciences或eBiosciency购买了以下细胞表面标记物和细胞因子的抗体：CD3、CD19、CD11b、Gr1、NK1.1、CD4、CD8、CD25、CD44、c-Kit、TCRβ、TCRδ、Vδ6.3、CCR6、CD24、IL-7R、CD27、CD45.1、IL-4、IL-17A、IFNγ、链霉亲和素-APC、链霉菌亲和素APCy7和链霉菌亲和素-PE-Cy7。CD1d-PBS57或αGC四聚体和对照未加载的CD1d四聚体以及加载有5-A-RU和甲基乙二醛（产生配体5-OP-RU）的MR1四聚体，以及加载有6-FP的对照MR1四分体均来自美国国立卫生研究院（NIH）四聚体核心设施。使用FOXP3染色试剂盒（eBioscience）对以下抗体进行核内染色：TCF1和LEF1（均来自Cell Signaling）；EGR2、T-bet和GATA3（均来自eBioscience）；Ki67（BD生物科学）；RORγt（电子生物科学）；圣克鲁斯生物技术公司；和GFP标签（Thermo）。使用从分子探针（Invitrogen）购买的抗抗体FITC Ab对LEF1和TCF1进行染色。对于PLZF染色，使用从eBioscience购买的抗小鼠FITC或APC Abs。采用驴抗兔IgG（Jackson ImmunoResearch）作为抗GFP抗体的二级抗体，在细胞无假染色的基础上筛选二级抗体。采用Annexin V（Leinco Technologies）和碘化丙啶（Invitrogen）染色法评估胸腺细胞存活率。用固定活性染料（Invitrogen）标记细胞，以便于在分析过程中排除死细胞。数据通过BD-LSRII细胞仪获得，并使用FlowJo（Treestar）进行分析。NKT细胞通过前向散射/侧向散射淋巴细胞群门控、前向散射面积与高度的双重排斥、活性染料进行常规鉴定⁻，B220/CD19⁻，TCRβ⁺和CD1d-PBS57⁺为了检测细胞因子，体外培养胸腺和LN细胞（2×10⁶/well）与PMA（10 ng/ml）和离子霉素（1µg/ml）在37°C下放置4小时，根据制造商的协议，1小时后添加高尔基塞和高尔基塞（BD Biosciences）。刺激后，使用Cytofix/Cytoperm试剂盒（BD Biosciences）对细胞进行细胞表面标记和细胞内细胞因子生成染色，或使用eBiosicence转录因子染色缓冲液集同时检测TF和细胞因子。细胞因子门⁺细胞总是基于用抗细胞因子抗体染色的非刺激性对照细胞。

αGC（KRN7000）购自Cayman Chemical，溶解于二甲基亚砜中，等分样品储存于−20°C。解冻后的等分试样在解冻后一天内没有重新冷冻或重复使用。将2µgαGC稀释在PBS或载体（Veh；PBS中的1%二甲基亚砜）中静脉注射给小鼠，然后在注射后的时间点对脾细胞进行分析，如图图例所示。为了评估体内αGC给药后iNKT细胞和NK细胞细胞因子的产生，在固定/渗透和细胞内染色之前，在冰上快速处理脾脏并立即染色，无需额外培养。

5 × 10⁶来自同类WT（Ly5.1/CD45.1）的混合BM细胞：Sox4系统CKO小鼠（比率从4:1到1:4不等）或对照Ly5.1 WT:Ly5.2 WT小鼠用于重建亚致死剂量照射的小鼠抹布1^−/−或致命照射的C57BL/6（Ly5.2）小鼠。骨髓细胞移植后10-14周处死嵌合体。米尔181a-1将编码序列（来自北卡罗来纳州达勒姆杜克大学Q.-J.Li的礼物）克隆到MSCV-IRES-GFP质粒中，并根据标准方案用于感染CD45.1先天性C57BL/6小鼠的BM祖细胞富集细胞（通过在细胞分离前3天注射5-FU）。感染的骨髓细胞被用于亚致死剂量照射后的重建抹布1^−/−或致命照射的C57BL/6（CD45.2）小鼠。在这两种宿主中观察到类似的结果。GFP的出现对重建进行了监控⁺骨髓细胞移植后8-16周处死血液中的细胞和小鼠。来自WT和Sox4系统-有或无外源性BM细胞缺陷米尔181a-1通过流式细胞术评估iNKT细胞分化的表达。

细胞内钙²⁺通过首先使用生物素化αCD3抗体激活胸腺细胞，然后对CD4和CD8进行细胞表面染色，并加载16µM Fluo-3（FL-1）和16µM Fura Red（FL-3）来测定流量。基线Ca²⁺在刺激前，通过与20µg/ml链霉亲和素的TCR交联作用服用2分钟。细胞内[Ca²⁺]通过对DP胸腺细胞进行门控并使用FlowJo计算FL1:FL3的平均荧光比率来确定。

为了分析基因组DNA中的Vα14-Jα18 TCR基因重排，使用PureLink genomic DNA Mini试剂盒（Invitrogen）对DP胸腺细胞进行分类并分离基因组DNA。PCR使用Taq公司聚合酶（Invitrogen）和以下热循环条件：94°C，3 min；94°C 35次循环，30 s；55°C，30秒；PCR产物立即在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，DNA通过溴化乙锭染色显示。引物序列为Va14F，5′-GTTGTCGTCAGGGAGAA-3′；Ja281 R，5′-TCCTAAGGCTGAACCTCTATC-3′；β-肌动蛋白F，5′-ATGAGATCGACCGAGCG-3′；β-肌动蛋白R，5′-TACTTGCGCTCAGAGGAG-3′。

在三个独立实验中，每个基因型的三只雄性小鼠的DP胸腺细胞的纯度均大于99%。在ImmGen处理中心（SOP，标准操作程序；2018年免疫基因组项目联盟). 如前所述，使用GenePattern模块（Broad Institute）进行微阵列数据分析(Narayan等人，2012年). 简言之，Multiplot（GenePattern）用于识别差异调节基因并生成火山图。如果基因的表达差异超过两倍，重复之间的变异系数（cv）小于0.5，并且Student’s吨试验P值<0.1。NCBI GEO数据库中提供原始数据(GSE120477标准). 对于iNKT单细胞RNaseq数据再分析，203个单细胞测序数据(GSE74597标准)使用R（数据包DEseq2）进行分析。从203个单细胞中读取归一化的热图计数。使用R包“pheatmap”应用行向聚类和列向尺度。基因列表基于群体的Tγδ17基因特征(Narayan等人，2012年)和sc级别(Spidale等人，2018年). iNKT亚群中选择基因的表达以点图表示，每个点代表一个细胞。

对总胸腺细胞（1–5×10）进行ChIP分析⁶)按照制造商的协议使用ChIP检测试剂盒（Millipore）。简言之，在去交联后，用qPCR（iQ SYBR Green Supermix和Bio-Rad iCycler）洗脱DNA-蛋白质珠复合物中的DNA，并用每个基因靶调控区域的特定引物进行检测。使用的抗体为抗（α）-SOX4（SCB；Santa Cruz Biotechnology）、αH3K4me3（17-614；Millipore）、αH3K9me3（17%-625；Millipore）和αH3K27me3（ab-6002；Abcam）。在表达转导或内源性靶基因的T细胞系中，与非表达者相比，抗体对TF的特异性得到了验证。参考基因组为小鼠mm9/NCBI37组装。PCR引物定位基于两种TF搜索工具（计算生物学研究联盟和Genomatix），通过以下方法评估物种之间的同源性网址：www.decode.org并在Primer Blast（国家生物技术信息中心）中设计。

图S1描述了T细胞中Cre介导的重组效率-Sox4系统^−/−小鼠和T和NKT细胞表型的更多细节-Sox4系统^−/−老鼠。图S2包括T中残留iNKT细胞的进一步表征-索克斯4^−/−小鼠，基于经典NKT细胞发育阶段和细胞因子产生。iNKT细胞中TCF1和SOX4的功能重叠也被研究。图S3重点介绍了iNKT细胞在T细胞中的残余功能-Sox4系统^−/−αGC处理后的小鼠。图S4测试iNKT细胞发育的候选分子和受SOX4调制的TCR信号。图S5显示Sox13系列报告人在iNKT细胞中的表达和对已发表的单细胞RNaseq数据的重新分析，以Tγδ17细胞基因特征为中心。

我们感谢李奇晶（北卡罗来纳州达勒姆杜克大学）米尔181表达载体Takeshi Egawa（密苏里州圣路易斯华盛顿大学）Sox4系统c-Myc缺陷小鼠和Paul Love（NIH，Bethesda，MD）的6F小鼠的表达没有改变。

这项工作得到了NIH拨款R21 AI07551和RO1 AI01301（给J.Kang）的支持。

作者声明没有竞争性的经济利益。

作者贡献：N.Malhorta进行了基础实验，分析了数据，准备了数字，并撰写了论文；Y.Qi进行了实验，分析了数据，并准备了数据；N.A.Spidale进行了实验，分析了数据，并准备了数据；M.Frascoli进行了实验，分析了数据，并准备了数据；B.Miu进行了实验，分析了数据，并准备了数据；O.Cho进行了ChIP实验，分析了数据，并准备了数据；K.Sylvia进行了实验，分析了数据，并准备了数据；J.Kang分析了数据，撰写了论文，并发起和指导了这项研究。