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Claudin-11在大鼠支持细胞中的表达和定位受雄激素调节在体外

在里面繁殖
作者：
Tu'uhevaha J Kaitu'u-Lino公司 澳大利亚维多利亚州克莱顿3168，莫纳什医学中心亨利王子医学研究所，邮政信箱5152，以及澳大利亚维多利亚州克利顿3168莫纳什大学解剖与细胞生物学、生物化学和分子生物学系

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信件应寄至P G Stanton；电子邮件：peter.stanton@princehenrys.org
内政部：
https://doi.org/10.1530/REP-06-0385
数量/发行：
第133卷：第6期
页面范围：
1169–1179
文章类型：
研究文章
在线发布日期：
2007年6月
版权：
©2007生殖与生育学会2007
免费访问

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Claudin-11和occludin是支持细胞之间紧密连接（TJs）的蛋白质成分，对维持血液-睾丸屏障很重要。屏障形成发生在青春期，有证据表明claudin-11和clodin都受激素调节。本研究旨在研究睾酮（T）和卵泡刺激素（FSH）对大鼠睾丸支持细胞TJs claudin-11和闭塞素mRNA表达的调节及其免疫定位在体外以及将任何类固醇调节与TJ的功能能力相关联。通过经上皮电阻（TER）评估，支持细胞在3天内形成功能性TJ。T和二氢睾酮显著(P（P）<0.01）3天内TER增加2倍，claudin-11 mRNA增加2至3倍。FSH部分刺激TER和claudin-11mRNA，但雌二醇无作用。T也促进了claudin-11在细胞间广泛接触中的定位。与claudin-11相反，Tand FSH并没有改变闭塞素mRNA的表达，但T以与claudin-11相似的方式促进了细胞接触处闭塞素的定位。在T刺激细胞中添加氟他胺导致TER和claudin-11 mRNA表达双倍下降，并导致细胞接触中这两种蛋白的丢失。氟他胺去除后，这种作用是可逆的。结论是，雄激素i）共同调节claudin-11 mRNA表达和TER，在TJ形成中暗示claudin11，ii）促进claudin-1和clodin在支持细胞接触处的定位。因此，雄激素维持精子发生的能力体内部分是通过它们对TJ蛋白的影响和对血液-睾丸屏障的调节。

摘要

Claudin-11和闭塞素是支持细胞之间紧密连接（TJs）中的蛋白质成分，对维持血液-睾丸屏障至关重要。屏障形成发生在青春期，有证据表明claudin-11和clodin都受激素调节。本研究旨在研究睾酮（T）和卵泡刺激素（FSH）对大鼠睾丸支持细胞TJs claudin-11和闭塞素mRNA表达的调节及其免疫定位在体外，并将任何类固醇调节与TJs的功能能力相关联。通过经上皮电阻（TER）评估，支持细胞在3天内形成功能性TJ。T和二氢睾酮显著(P（P）<0.01）3天内TER增加2倍，claudin-11 mRNA增加2至3倍。FSH部分刺激了TER和claudin-11 mRNA，而雌二醇无影响。T也促进了claudin-11在细胞间广泛接触中的定位。与claudin-11相反，Tand FSH并没有改变闭塞素mRNA的表达，但T以与claudin-11相似的方式促进了细胞接触处闭塞素的定位。在T刺激细胞中添加氟他胺导致TER和claudin-11 mRNA表达双倍下降，并导致细胞接触中这两种蛋白的丢失。氟他胺去除后，这种作用是可逆的。结论是，雄激素i）共同调节claudin-11 mRNA表达和TER，在TJ形成中暗示claudin11，ii）促进claudin-1和clodin在支持细胞接触处的定位。因此，雄激素维持精子发生的能力体内部分是通过它们对TJ蛋白的影响和对血液-睾丸屏障的调节。

介绍

构成血液-睾丸屏障的髓间细胞连接复合体位于生精上皮基底部周围，由各种类型的细胞连接组成，包括紧密连接（TJs）、粘附连接、桥粒样连接、，缝隙连接和一种睾丸特异的含肌动蛋白的连接结构，称为胞质特化(Russell&Peterson 1985年,Pelletier&Byers 1992年,穆霍兰德等。2001,路易斯等。2003b条,2003c（c）,富山等。2003,Mruk&Cheng 2004年). 输精管维持一个选择性渗透屏障，将生精上皮分为基底层（血-睾丸屏障外）和管腔层（内部）。这个屏障阻止了分子的双向通过(Russell&Peterson 1985年)并创造生殖细胞减数分裂和成熟所需的特殊微环境，使其在内腔室中在生化和免疫学上与睾丸的其余部分不同(Maddocks&Setchell 1990年). 众所周知，TJ功能的破坏会导致生殖细胞闭锁、精子生成停止以及隔离抗原可能受到免疫攻击(Russell&Peterson 1985年).

已经描述了多种上皮细胞中参与TJ的几种跨膜蛋白，包括克劳丁、闭塞素和连接粘附分子（JAM）；有关综述，请参阅冈萨雷斯-数学等。2003,Ebnet公司等。2004,费尔德曼等。2005,科瓦尔2006). 小鼠和大鼠睾丸TJ含有闭塞素(斎藤等。1997,莫罗伊等。1998,Cyr公司等。1999)，克劳丁家族的一些成员(森田等。1999一)包括第11条(森田等。1999b条,海拉尼等。2000)和克劳丁-3(孟等。2005)，以及JAM-A和JAM-C(奥兰·利昂等。2001,格利基等。2004). claudin-11基因敲除雄性小鼠不育，缺乏功能性支持细胞TJ和成熟精子(高等。1999,米提克等。2000)而闭塞素敲除小鼠睾丸中含有生殖年龄动物的正常生殖细胞补体(斎藤等。2000). 然而，大鼠睾丸闭锁素功能的抑制导致生殖细胞的丢失体内并部分破坏支持细胞TJs的形成在体外(钟等。2001)提示闭塞素可能参与TJ功能。JAM-A淘汰赛很有吸引力(Cera公司等。2004)JAM-C基因敲除小鼠的血睾屏障仍有功能(格利基等。2004). 因此，来自这些模型的证据表明，claudin-11是参与支持细胞TJs形成和功能的主要成分，还有来自cloddin的额外输入。

虽然还不清楚，但血液-睾丸屏障功能与内分泌状态之间存在关联。例如，随着卵泡刺激素（FSH）和黄体生成素的增加，支持细胞TJ和由此产生的不透性屏障首先出现在青春期（15-20天龄）大鼠睾丸中(Russell&Peterson 1985年,罗素等。1989)，并且TJ的形成可以被延迟(维塔尔等。1973)或在缺乏这些激素的情况下被阻止(Bressler 1976年). 同样，用促性腺激素治疗性腺机能减退性性腺功能减退男性可以将支持细胞TJ从青春期前表型转化为成熟的连接结构(de Kretser&Burger 1972年).

支持细胞TJ蛋白和雄激素之间的直接联系最近已经建立。雄激素上调原代培养的小鼠和大鼠支持细胞中claudin-11 mRNA的表达在体外(Gye 2003年,弗洛林等。2005)并且上调Sertoli样TM4细胞系中claudin-3 mRNA和蛋白的表达(孟等。2005). 虽然这些模型中闭塞素的调控尚不清楚体内雄激素拮抗剂氟他胺对成年大鼠的治疗使睾丸闭塞素mRNA表达降低约40%(Gye&Ohsako 2003年). 尽管有这些研究，激素（雄激素，FSH）调节支持细胞TJ蛋白和功能的机制仍有待阐明。最近，我们证明了FSH对于椎间细胞连接复合体中其他两种连接类型（粘附连接和胞质特异性）的形成至关重要，雄激素没有明显作用(斯卢卡等。2006). 在当前的研究中，我们使用了在体外支持细胞在两院制培养中的模型(哈德利等。1987,汉德尔斯曼等。1989,小野田等。1990,珍妮基等。1991一,Djakiew&Onoda 1993年)研究雄激素和FSH对TJ的影响。通过测定跨上皮电阻（TER；珍妮基等。1991一,1991b条,1992,钟等。1999,扇形风扇等。1999,Chung&Cheng 2001年,李等。2001,路易斯等。2003一,小（Siu）等。2003). 已知睾酮和FSH单独或联合使用可使大鼠支持细胞TER增加两到三倍(珍妮基等。1991一,1991b条,Steinberger&Klinefelter 1993年)提示支持细胞TJ功能可由促性腺激素调节。因此，本研究的目的是通过将类固醇（T、DHT和雌二醇（E2））治疗和FSH的效果与TJ的功能能力（通过监测TER）以及TJ蛋白mRNA表达和免疫定位相关联，进一步阐明关键TJ成分（claudin-11、claudin-3、clodin）的激素调节。

材料和方法

动物

从莫纳什大学动物服务中心（澳大利亚墨尔本）获得19至21天大的雄性远交Sprague-Dawley大鼠。一氧化碳致大鼠死亡2立即取出窒息和睾丸以分离支持细胞。莫纳什医学中心动物伦理委员会批准使用动物进行本研究。

培养实验用支持细胞的制备

如前所述，从19–21天龄的Sprague-Dawley大鼠中分离出初级支持细胞(佩里曼等。1996,斯卢卡等。2006). 将新分离的Sertoli细胞悬浮在无血清的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）/火腿F12培养基（1:1）中，补充有我-谷氨酰胺（1 mM，Trace Scientific，澳大利亚墨尔本）、非必需氨基酸（1:100稀释100倍储备，Trace）、NaHCO三（1.4 mM，微量）、BSA（1%（w/v），西格玛化学公司）、HEPES（10 mM，痕量）、胰岛素（5μg/ml Novo-Nordisk，澳大利亚新南威尔士州悉尼）、转铁蛋白（5μg/ml，西格马）、亚硒酸钠（50 ng/ml，Sigma）和青霉素（200 U/ml）-链霉素（200μg/ml）-真菌酮（0.5μg/ml；CSL，澳大利亚墨尔本）。细胞以1.25×10的密度进行电镀6细胞/厘米2放入24孔培养板（Nunc，Nalge Nunc International，Denmark）进行总RNA分离，或放入Millicell PCF双腔室（直径12 mm，孔径0.4μm，0.6 cm2表面积；Millipore，Bedford，MA，USA），用于TER和免疫细胞化学的测量。在使用Matrigel（BD BioSeciences，Bedford，MA，USA）之前，在DMEM/F12培养基中以1:8的稀释度对所有细胞培养表面（24孔板，双腔室）进行预涂。然后在37°C下，在95%空气–5%CO的增湿环境中培养细胞2（v/v）持续5-13天，隔离日指定为第0天。每2天定期更换一次培养基。第3天，用10%的培养基在水中低渗冲击细胞45秒，以溶解污染的生殖细胞(加尔迪耶里等。1983)然后用DMEM/F12清洗细胞一次，并返回培养箱进行剩余培养期。用这种方法制备的支持细胞培养物通常纯度为92%，剩余细胞为肾小管周细胞和残余生殖细胞(佩里曼等。1996,兰帕等。1999).

除非另有说明，否则在第0天以以下浓度添加激素治疗：睾酮（T），28μg/ml（西格玛）；人重组FSH，2.35 IU/ml（普雷贡，奥加纳，奥斯，荷兰）；DHT，28纳克/毫升（西格玛）；E2，28纳克/毫升（西格玛）；氟他胺，27.6μg/ml（西格玛）。从乙醇中的储备溶液中制备甾体，并在使用前立即在DMEM/F12中稀释，同时向未接受甾体治疗的所有其他培养孔中添加等量的乙醇（最终0.26%v/v）。

TER的测量

为了评估贝托利细胞间TJ的组装，使用Millipore Millicell电阻系统（Millipore-Millicell-electrical resistance system）对Sertoli细胞上皮的TER进行量化，从电镀当天（第0天）开始每天进行测量。为了提高测量的再现性，在TER测量之前，允许培养细胞在室温下平衡30分钟。通过减去涂有Matrigel但不含细胞的双腔室的平均TER，并校正PCF双腔室（0.6 cm）的表面积，计算最终电阻读数2)产生以Ω/cm表示的值2。所有TER值都是从三个重复的培养孔中计算出来的。

总RNA和RT的分离

根据制造商的说明，使用总RNA提取试剂盒（Qiagen）在指定的时间点去除细胞，以提取总RNA。使用DNAse-free试剂盒（Ambion，Austin，TX，USA）去除所有污染DNA，并将样品储存在−80°C下。如其他地方所述，使用核糖核酸酶荧光RNA分析法（美国俄勒冈州尤金市分子探针公司）测定总RNA浓度(斯卢卡等。2002).

使用AMV-逆转录酶（8 U；Roche）、随机六聚体引物（200 ng；Amersham Biosciences）、dNTPs（每个20 nmol；Roches）、RNasin（20 U；Promega）和5×反应缓冲液（Roche，之后，将样品在95°C下加热2分钟，然后在−20°C下储存。

实时PCR

使用Roche Lightcycle（Roche）和FastStart DNA Master SYBR-Green 1系统（罗氏）进行定量实时PCR分析。claudin-11（正向5′-TTAGCATGGGCACTCTTGG-3′，反向5′-ATGTAGCCACTGCTCTC-3′）、occludin（正向：5′-CTGTCATGCGTCATCG-3′，反向5′-CTCCCGATCTAATGACGC-3′）和claudin-3（正向5′-CGTTAGCGTGCTCGTCCAT-3′，反向5′-CCGAAGGCTCCAGTAGGATA-3′）的寡核苷酸引物从已发表的来源获得(钟等。2001,路易斯等。2001)或是使用Oligo程序设计的（版本6；Molecular Biology Insights，Cascade，CO，USA）。对于PCR分析，样品cDNA稀释1:20至1:150倍，PCR条件包括Mg2+表1总结了底漆浓度、退火时间和延长时间用成年大鼠睾丸cDNA稀释液制备任意单位的cDNA，生成PCR分析的标准曲线。除非另有说明，否则所有样品的PCR均采用三次重复反应进行38个循环，然后进行熔融曲线分析，以监测PCR产品纯度（见表1). 在最初的实验中，通过琼脂糖凝胶电泳和DNA测序证实了单个PCR产物的扩增。

免疫细胞化学

为了进行免疫细胞化学分析，PCF过滤器上的Sertoli细胞单层在冰上用含有0.2%（v/v）Triton X-100的冰镇PBS（PBS；10 m 0.01 m PBS和154 mM NaCl）预萃取2 min，然后在室温下在PBS中的3%多聚甲醛中固定30 min。然后用0.05%（v/v）Triton X-100在PBS中用冰渗透细胞5分钟，并在PBS洗涤。用含有10%正常血清（绵羊或兔子）的CAS块（Zymed，San Francisco，CA，USA）封闭非特异性结合位点20分钟。使用的主要抗血清是亲和纯化的兔抗闭塞素（2.5μg/ml，Zymed）或在PBS/bSA中稀释的兔抗克劳丁-11（1:400，CovalAb），并在室温下与细胞孵育过夜。然后清洗细胞单层，并在室温下应用次级抗血清（山羊抗兔Alexafluor-488 1:100稀释液；分子探针或生物素化羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）1:100稀释）1小时。然后用链霉亲和素–Alexafluor 488（1:100，30分钟，分子探针）对Claudin-11免疫染色进行可视化，并用荧光染色剂DAPI（90μM）和TO-PRO-3碘化物（10μM，PBS/bSA；分子探针）将单层复染5分钟，以便进行核可视化。然后用PBS/bSA将单层冲洗三次，并用FluorSave试剂（Calbiochem，加州圣地亚哥，美国）将其安装在玻璃载玻片上。

使用配备Fluoview 4.2版软件（Olympus）的Olympus-Fluoview FV300共聚焦系统进行共聚焦分析，并将其连接到Olympus IX 81倒置显微镜上。使用60×浸水透镜，共焦孔径设置为2，激光强度设置为5%，软件变焦设置为×2，软件滤波模式设置为Kalman，4次扫描。Alexa Fluor 488（绿色）的激发使用氩激光的488 nm线，而TO-PRO-3碘化物（红色）的激发则使用红色HeNe激光的633 nm线。支持细胞单层最初通过外荧光显微镜进行可视化，并选择包含椎间细胞连接的光学平面进行图像捕获。双标记实验的共聚焦扫描按顺序进行，以防止红色和绿色输出通道之间的出血。

闭塞素和克劳丁-11的免疫印迹分析使用与免疫细胞化学相同的抗体，细胞提取物在热的非还原性样品缓冲液（125 mM Tris–HCl，2.5%（w/v）SDS，10%（w/v）甘油，pH 6.8）中制备，在10%聚丙烯酰胺凝胶上电泳(莱姆利1970)并印在PVDF膜上（Immobilon-P，Millipore）。检测采用辣根过氧化物结合物结合ECL western blot检测系统（Amersham Biosciences）。

统计分析

TER值(n个=3口井/处理）和PCR数据(n个=3从两个孔收集的总RNA中进行PCR估计），计算为平均值±标准差。来自单一文化。每项研究重复2-3次，结果部分给出了具有代表性的实验。使用GB Stat（Dynamic Systems Inc.，Silver Spring，MD，USA）进行统计分析，并对所有组的方差同质性进行初步评估。采用单因素方差分析（ANOVA）对均质组进行评估，然后使用Newman–Keuls进行评估临时的多重比较测试。当各组为非参数组时，数据为对数10并重复上述测试。使用Kruskal–Wallis检验和Newman–Keuls模拟检验（等于ns）分析剩余的非参数数据。

结果

雄激素刺激支持细胞TER

当Sertoli细胞在无血清DMEM/F12的Matrigel-coated双腔培养箱中培养时，根据TER的测量，TJ通常在电镀后的前2–3天内形成。在控制条件下，TER达到60–80Ω/cm的稳定值2接合形成后不久（第2–3天，图1)此后略有增加（直到第7天；图1)，（或直到第13天（见图4A))达到最大~130Ω/cm2.A重要(P（P）与对照孔相比，与添加T（28 ng/ml）培养的支持细胞相比，在第3天后观察到1.5到2倍的TER刺激时，观察到TER增加（图1，另请参见图4A和B). 用T（28 ng/ml）+FSH（2.35 IU/ml）培养的Sertoli细胞也观察到类似的结果，与对照组相比有两倍的差异，这在第5天后很明显（图1). FSH单独产生的(P（P）<0.05）TER增加，但直到培养第5天和第7天才观察到这种情况（图1). E2（28 ng/ml）单独对TER没有影响（数据未显示）。DHT（28 ng/ml）处理的细胞与T处理的培养物反应相似（数据未显示）。这些结果表明，T和较小程度的FSH刺激Sertoli细胞TER。

睾酮刺激克劳丁-11 mRNA，但不刺激闭塞素或克劳丁-3 mRNA的表达

采用实时RT-PCR检测三种TJ跨膜蛋白claudin-11、clodin和claudin-3的表达。在对照条件下，claudin-11 mRNA表达略有但显著增加(P（P）=0.015）（图1B)而T显著刺激了claudin-11 mRNA的表达(P（P）<0.01），并且在第5-7天比对照组高出两到三倍。用T加FSH处理的细胞对单独的T有类似的反应（图1B)而在第3-7天，FSH单独提高了claudin-11 mRNA的表达，大约是对照孔的两倍（图2B). E2对claudin-11表达的影响不大，仅在治疗7天后显著增加（图1B)而DHT以与T相似的方式增加了claudin-11 mRNA的表达（数据未显示）。

与claudin-11相比，在所有治疗组的整个培养过程中，闭塞素mRNA表达水平保持相对稳定（图1C)没有证据表明激素刺激mRNA表达。尽管最近的数据表明，在小鼠新形成的支持细胞TJs中存在claudin-3 mRNA表达(孟等。2005)，我们在大鼠Sertoli细胞培养系统的任何时候都无法通过PCR检测到该蛋白（数据未显示）。随后的研究表明，在成年大鼠睾丸的间质中，claudin-3免疫染色呈阳性，但在生精上皮中未呈阳性（Stanton未发表的观察结果）。

这些结果表明，T和FSH刺激大鼠支持细胞中claudin-11 mRNA的表达，但不刺激闭塞素mRNA的表示，而claudin-3在大鼠支持细胞核中不表达。

Claudin-11 mRNA表达与TER相关

通过TER测定闭塞素和claudin-11 mRNA表达与脊髓间细胞TJ功能之间的相关性，以评估这些变量是否相关。无显著关系(第页=0.212,n个=32，ns）。相反，一个显著的相关性(第页=0.534,n个=32,P（P）所有治疗组的汇总数据（图2A）在claudin-11 mRNA表达和TER之间观察到<0.01）)，在T治疗组中保持(第页=0.790，n个=8,P（P）< 0.02; 图2B).

睾酮刺激皮质间细胞接触时claudin-11和clodin的定位在体外

Claudin-11蛋白被检测为大鼠Sertoli细胞中27kDa的主要带（图3H)正如其他地方报道的那样(海拉尼等。2000,弗洛林等。2005). 在对照条件下，在第1天（数据未显示）和第5天（图3A），支持细胞接触点和支持细胞细胞质中的claudin-11点状免疫染色明显)而在第9天和第13天的扩展培养中，含有claudin-11的更广泛接触明显（图3B和C). 相反，用T处理5天的细胞中claudin-11免疫染色显著上调（图3E)存在于支持细胞的细胞质中以及支持细胞之间的广泛接触中。这种免疫染色模式在连续接受T治疗9天和13天的细胞中得以保存（图3F和G).

在大鼠支持细胞（图3L）中，在~57 kDa处观察到闭塞蛋白是一条主要的免疫反应带)与公布的数据一致(古施等。1993,榊原等。1997)，尽管有其他次要带（87、42和36 kDa，图3L)也观察到了。在对照条件下，在第1天（数据未显示）和第7天（图3I），在支持细胞接触处观察到点状闭塞素免疫染色). 相反，用T处理7天的支持细胞，在支持细胞间接触时，闭塞素定位显著增加（图3J)与对照培养基进行比较。在细胞核内观察到claudin-11的有限非特异性染色（图1D)然而，未观察到闭塞素的非特异性染色（图1K)当主要抗体被替换为非特异性兔IgG时。

氟他胺拮抗睾丸酮刺激的TER和claudin-11 mRNA在支持细胞中的表达

仅在培养基中允许支持细胞形成TJ 5天，然后添加雄激素受体拮抗剂氟他胺4天。在控制条件下（图4A)在培养第9天加入氟他胺后，与单独培养基中的细胞相比，TER降低了两倍。同样，重要的(P（P）<0.01）当将氟他胺添加到预先用T刺激的Sertoli细胞中5天时，观察到TER下降了三倍以上，达到与非刺激细胞相同的水平（图4B). 这种作用是可逆的，在培养第9天用任何一种培养基替代氟他胺（图4A)，或使用T（图4B)2天内，TER恢复到治疗前水平。持续用T处理13天的支持细胞的TER继续增加至~350Ω/cm2并且似乎没有达到最大值，尽管这种增加可能是双相的，在第3-5天左右处于平稳状态（图4B).

采用上述TER相同方案处理的细胞中也测量了Claudin-11 mRNA的表达（图4C). 与早期实验一致（见图1)，T持续刺激的支持细胞单层中claudin-11 mRNA的表达显著(P（P）<0.05）在第5天、第9天和第13天，与各自的对照组相比升高（仅中等-开放圆）。当T在第5天被移除并被氟他胺（闭合方块）替代时(P（P）<0.01）>在第9天观察到claudin-11 mRNA表达减少了三倍，与同样用拮抗剂（闭合圈）处理的中克隆细胞相比，claudin11 mRNA表达没有差异。此外，在第5天和第9天之间，中克隆和中克隆加拮抗剂治疗组的claudin-11 mRNA表达没有差异。在第9天从细胞中取出氟他胺并用单独培养基或睾酮替代后，在第13天未观察到claudin-11 mRNA表达的显著变化。

与claudin-11 mRNA的减少相结合，氟他胺治疗T刺激细胞也导致培养第9天在树突状细胞间接触处claudin-1免疫染色显著丢失，但一些细胞质染色仍然明显（与图3F相比带4D). 在对照培养物中观察到氟他胺对claudin-11免疫染色的类似作用（数据未显示）。这种作用似乎是可逆的，因为在接下来的4天（到第13天）内用T替代氟他胺会导致在贝托利细胞间接触处再次出现claudin-11免疫染色（图4E). 也观察到细胞接触时闭塞素免疫染色的类似调节（数据未显示）。

讨论

本研究证实，睾酮和DHT在大鼠Sertoli细胞形成TJ的过程中显著增加了claudin-11 mRNA表达两到三倍体外试验。这种增加是雄激素依赖性的，因为E2不会复制，但会被非甾体雄激素受体拮抗剂氟他胺抑制。雄激素和较小程度的FSH也增加了由TER定量的支持细胞TJs的“紧密度”，从约80Ω/cm的基础值增加到≥150Ω/cm2TER和claudin-11 mRNA表达之间的显著相关性表明claudin11在支持细胞TJ形成中起主要作用。雄激素还增加了支持细胞中claudin-11的细胞质染色及其在广泛的支持细胞间接触中的定位体外试验。相反，支持细胞闭塞素mRNA的表达不受激素（T、E2、FSH）的调节，尽管T确实以与claudin-11类似的方式促进了闭塞素在脊髓间细胞接触中的定位。因此，这些研究表明雄激素可促进两种关键TJ蛋白的合成和/或定位到贝托利细胞间接触区域体外试验。

我们的研究表明，大鼠支持细胞TJ功能和TJ蛋白（claudin-11和occludin）以双相方式调节在体外，含有一个基础成分和第二个雄激素调节成分。仅在介质中，TJ的平均TER为~80Ω/cm2在此期间，claudin-11-和clodin-mRNA的表达也很明显，点状claudin11和clodin蛋白定位于脊髓间细胞接触处。因此，我们认为这种表达水平和定位包括支持细胞TJ功能的基本组成部分。与对照组相比，雄激素（T或DHT）显著增加了TER和claudin-11 mRNA两到三倍，增加了细胞质claudin11染色，并将这两种蛋白并入广泛的细胞间接触。因此，我们认为这是TJ功能的雄激素调节成分。将雄激素受体拮抗剂氟他胺添加到T刺激细胞中，抑制了该成分的克劳丁-11 mRNA表达，同时显著降低了细胞表面的克劳丁11和闭塞素定位，同时TER降低到基础水平。这种作用是部分可逆的，因为用T替代拮抗剂可以恢复两种蛋白的TER和连接免疫染色；然而，没有观察到claudin-11 mRNA表达的显著增加。虽然这一结果可能表明氟他胺在本研究中有不良或毒性作用，但我们注意到，与其他药物相比，所使用的拮抗剂浓度（~100μM）为中等范围在体外使用0.5μM浓度的大鼠支持细胞研究(Swift&Dias 1988年)，1微米(林格等。2000)或3 mM(Gorczynska&Handelsman 1995年).

来自支持细胞雄激素受体（SCARKO）条件性敲除小鼠的数据证实了在体外研究结果表明，两个成年人的claudin-11 mRNA表达显著降低40%(棕褐色等。2005)和青春期(王等。2006)老鼠。其他在体外(Gye 2003年,弗洛林等。2005)研究还表明，睾酮上调支持细胞中claudin-11 mRNA的表达，尽管我们的研究首次表明claudin11 mRNA与TER之间存在直接联系，从而表明claudin-11是支持细胞TJ功能的主要贡献者(科瓦尔2006). 另一种雄激素调节的克劳丁，克劳丁-3，最近被定位于小鼠血液-睾丸屏障，在那里它可能参与新形成的TJ(孟等。2005). 我们无法在连接形成期间的任何时间检测大鼠睾丸支持细胞培养系统中claudin-3 mRNA的表达，或通过免疫组织化学定位在成年大鼠睾丸中，不支持该蛋白在大鼠睾丸内的作用。

在这里和其他地方观察到的雄激素可以调节支持细胞TJs的“紧密性”的程度(珍妮基等。1991一,Gye 2003年)，对理解这些连接的功能很有兴趣。在基础条件下，具有类似细胞板密度的大鼠支持细胞的TER通常为60–100Ω/cm2（本研究，珍妮基等。1991一,1991b条,Chung&Cheng 2001年,李等。2001,路易斯等。2001,小（Siu）等。2003)，大于哺乳动物肾近端小管细胞形成的“渗漏”TJ（6–7Ω/cm2；扇形风扇等。1999)，但小于肾集合管（300Ω/cm2)或膀胱的致密上皮（≥6000Ω/cm2；扇形风扇等。1999). T刺激5-7天后，TER值从150Ω/cm增加到250Ω/cm2; 然而，数值约为350Ω/cm2连续培养13天后观察到，很明显尚未达到平台。这表明，在Sertoli细胞培养中建立TJ的最佳条件尚未达到，这得到了高达10倍的TER（~800Ω/cm）的支持2)在别处观察到(珍妮基等。1991一,1991b条).

FSH在支持细胞TJ调节中的作用在体外仍然是一个问题。我们的研究表明，虽然FSH可以上调claudin-11 mRNA的表达，但TER没有发生相同程度的改变。其他研究表明FSH对TER有更大的上调作用(珍妮基等。1991一)或FSH对claudin-11 mRNA表达的抑制作用(海拉尼等。2000)导致我们假设在体外培养方法可以改变FSH的剂量-反应特征。也有人推测FSH可能暂时刺激蛋白酶活性以改变TER(珍妮基等。1991一,Chung&Cheng 2001年).

一些证据表明促性腺激素对支持细胞TJ的形成和功能很重要在体外（本研究，珍妮基等。1991一,1991b条,Gye 2003年)和体内(维塔尔等。1973,Bressler 1976年,Russell&Peterson 1985年,伯格曼1987,罗素等。1989,Gye&Ohsako 2003年). 在几种仓鼠中(伯格曼1987,伯格曼等。1989)和貂皮(Pelletier 1988年)，组成血液-睾丸屏障的TJ随着光周期和循环性促性腺激素的变化而经历周期性破坏和再现。我们最近证明，在成年短日Djungarian仓鼠中，两种TJ相关蛋白claudin-11和ZO-1的定位被广泛破坏(塔鲁利等。2006)血清促性腺激素水平低，缺乏功能性TJ(伯格曼1987). 外源性FSH恢复了这些蛋白质的组织，以类似于在长日仓鼠的功能性TJ中观察到的定位(塔鲁利等。2006). 在小鼠中，SCARKO的消融导致血液-睾丸屏障对生物素示踪剂的渗透性增加(孟等。2005)，证实雄激素在该物种中的作用。相反，来自大鼠的现有数据表明，通过选择性Leydig细胞毒物乙烷二甲基磺酸钠短期（6-8天）雄激素戒断后，TJ在形态上仍然存在(克尔等。1993)或垂体切除术后长期（41天）停用促性腺激素(弗朗卡等。1998)，尽管在这些模型中没有测试血液-睾丸屏障功能。检测大鼠支持细胞TJs体内在促性腺激素或选择性雄激素停药后变得“渗漏”。这些研究对于理解为什么在血清促性腺激素抑制后接受激素避孕的男性中会出现不均匀的无精子症诱导具有重要意义(1990年世界卫生组织,1996).

在精子发生过程中，生殖细胞必须通过血-睾丸屏障转移到管腔室。虽然这种易位的机制尚不清楚，但支持细胞TJ的重塑是理所当然的(Russell&Peterson 1985年,Pelletier&Byers 1992年). 除了本研究中显示的雄激素的刺激作用外，大鼠睾丸支持细胞TER还可被一些睾丸细胞因子和生长因子（包括TGF-β3）负调控(路易斯等。2001,2003一,小（Siu）等。2003)和TNFα(路易斯等。2003c（c）,小（Siu）等。2003; 有关评论，请参见Wong&Cheng 2005年,夏等。2005)TNFα也能下调闭塞素和克劳丁-11 mRNA的表达(海拉尼等。2000,小（Siu）等。2003). 雄激素受体水平在大鼠精子发生的第VII-VIII阶段最高(布雷姆纳等。1994)在初级精母细胞移位到管腔室之前(Russell&Peterson 1985年). 因此，支持细胞TJ功能和TJ蛋白表达可由激素和局部因素上调或下调在体外.

除这些变化外，我们的数据还表明，TJ蛋白的内吞或再循环过程可能有助于大鼠支持细胞的TJ功能，如氟他胺治疗后细胞接触中克劳丁-11和闭塞素的耗竭所示。拆除TJ结构，包括第3条(松田等。2004)通过内吞作用，各种上皮细胞中与内吞作用相关的过程得到了很好的认识（有关综述，请参阅Ben-Shaul&Ophir 2001年); 然而，Sertoli TJs蛋白和功能以这种方式调节的程度体内还有待确定。

总之，本研究表明claudin-11在支持细胞TJs的建立和功能中起着重要作用在体外雄激素促进了claudin-11在椎体间细胞接触中的表达和定位。此外，虽然雄激素不能直接调节闭塞素mRNA的表达，但这项研究表明雄激素可以促进闭塞素蛋白在脊髓间细胞接触处的定位。与最近相比体内在小鼠的研究中，没有证据表明claudin-3在大鼠支持细胞TJs形成中的作用在体外无法找到。总之，这些数据表明雄激素维持精子发生的能力体内部分是通过它们对支持细胞TJ蛋白的影响和对血液-睾丸屏障的调节。

表1

用于检测基因PCR扩增的引物特异性LightCycler条件。

姓名产品尺寸（bp）底漆浓度（百万摩尔）镁2+ 浓度（百万分之一）退火温度（摄氏度）延长时间（s）数据采集温度（摄氏度）一PCR产品熔化温度（摄氏度）b条
一指在LightCycler分析期间定量PCR产物荧光的温度。
b条通过对LightCycler的熔融温度分析确定。
克劳丁-1162440368258591.7
闭塞素29440464208589.2
克劳丁-3436402.564237293
图1
图1

激素处理对椎间紧密连接通透性和紧密连接蛋白mRNA表达的影响在体外（A）从第0天开始，每天测量支持细胞上皮的跨上皮电阻（TER）。支持细胞（1.25×106细胞/厘米2)在基本条件下（单独培养基，○）或在FSH（2.35 IU/ml；•）、睾酮（T；28 ng/ml；△）或T（28 ng/ml）+FSH（2.3 5 IU/ml；△）的持续存在下，在DMEM/F12/1%BSA的Matrigel-coated双腔培养箱中培养7天，如箭头所示（↓），每隔2天更换培养基和处理液。第3天，用低渗溶液处理所有细胞，以去除污染的生殖细胞。结果表示为平均值±标准差。一个培养基中有三个重复的微孔，显示了三个培养基的代表性。通过单向方差分析（ANOVA）和纽曼-凯尔斯（Newman-Keuls），星号表示每一天与基础培养物的显著差异临时的分析测试(*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01). （B） 通过实时PCR测量培养的支持细胞（1.25×106细胞/厘米2)在Matrigel-coated塑料24孔培养板中进行处理，如（A）所述。还包括在（B）中添加雌二醇（E2，28 ng/ml，▾）的数据。结果表示为平均值±标准差。从一个培养基中分离出三个重复的微孔，并显示了一个代表性培养基。

引文：再版133,6；10.1530/REP-06-0385

图2
图2

TER与claudin-11 mRNA表达的关系。构建了所有治疗组（单独培养基（○）、FSH（•）、T（△）、FSH+T（△。观察到整个数据集之间存在显著相关性（A）(第页=0.534，P（P）< 0.01,n个=32），也适用于T治疗组（B）(第页=0.790,P（P）< 0.02,n个=8).

引文：再版133,6；10.1530/REP-06-0385

图3
图3

雄激素治疗对脊髓间细胞接触时克劳丁-11和闭塞素定位的影响在体外支持细胞在Matrigel-coated双腔培养箱中培养，培养条件为基础条件（单独培养基）、（A–C和I组）或添加睾酮（28 ng/ml，E–G和J组），培养时间段如图所示（天）。然后用TO-PRO-3碘化物核复染（红染）对claudin-11（面板A-G）或clodin（面板I-J；绿色染色）进行共聚焦免疫荧光染色。通过用等效浓度的非特异性兔IgG替代每个一级抗体来评估非特异性结合（D组用于claudin-11，K组用于clodin）。棒材=10μm。用免疫组化所用的相同一级抗体，以及在睾酮存在下培养5-7天的细胞提取物，对克劳丁-11（H组）或闭塞素（L组）进行蛋白质印迹检测。

引文：再版133,6；10.1530/REP-06-0385

图4
图4

雄激素受体拮抗剂氟他胺对TER和克劳丁mRNA表达和蛋白定位的影响。如图1图例所示，在单独培养基（A）或睾酮（28 ng/ml，B）存在下培养支持细胞每天进行TER测量。第5天，将每组细胞清洗并置于含有氟他胺（28μg/ml；•或▪) 如垂直虚线所示，持续4天。开放符号（○，□）表示单独或加睾酮培养基中未接受氟他胺治疗的细胞。第9天，取出氟他胺，将细胞放回单独培养基或培养基加睾酮（28 ng/ml），直到第13天培养结束。如箭头所示，进行了常规介质更换。在第0天、第5天、第9天和第13天，去除细胞，提取总RNA进行RT和实时PCR。C组显示了单独培养基（○）或睾酮（□）连续处理细胞的claudin-11 mRNA表达数据，以及对照（•）或睾丸激素处理细胞的数据(▪), 在第5天到第9天接受氟他胺治疗。数据以平均值±表示标准差。(n个=3 PCR估计值），星号表示与单向方差分析和Newman–Keuls确定的各自对照组相比存在显著差异临时的分析测试(*P（P）<0.05**P（P）<0.01，ns，不显著）。a对b；P（P）<0.01，c对d；纳秒。如图2所示，对claudin-11进行免疫组织化学与氟他胺培养并在第9天取样的睾酮处理细胞图例（面板D，相当于▪ B组第9天），或睾酮替代后的细胞，并在第13天取样（E组，相当于▪ 第13天，面板B）。

引文：复制133，6；10.1530/REP-06-0385

收到2006年12月21日第一次决定2007年1月26日接受2007年2月22日

作者感谢DM Robertson博士在本研究过程中进行的有益讨论，感谢L O’Donnell博士和RI McLachlan博士对手稿的批判性评论，感谢S Panckridge女士对数字的帮助。本研究由澳大利亚国家卫生和医学研究委员会（Regkey no.241000）的项目拨款资助。作者声明，不存在会影响这项科学工作公正性的利益冲突。

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    图1

    激素处理对椎间紧密连接通透性和紧密连接蛋白mRNA表达的影响在体外（A）从第0天开始，每天测量支持细胞上皮的跨上皮电阻（TER）。支持细胞（1.25×106细胞/厘米2)在基础条件下（单独培养基，○）或在FSH（2.35IU/ml；•）、睾酮（T；28ng/ml；△）或T（28ng/ml）+FSH（2.35IU/ml，如箭头所示（↓），每隔2天更换培养基和处理液。第3天，用低渗溶液处理所有细胞，以去除污染的生殖细胞。结果表示为平均值±标准差。一个培养基中有三个重复的微孔，显示了三个培养基的代表性。通过单向方差分析（ANOVA）和纽曼-凯尔斯（Newman-Keuls），星号表示每一天与基础培养物的显著差异临时的分析试验(*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01). （B） 实时PCR检测培养的支持细胞（1.25×10）中Claudin-11 mRNA表达和（C）cloddin mRNA表达6细胞/厘米2)在Matrigel-coated塑料24孔培养板中进行处理，如（A）所述。还包括在（B）中添加雌二醇（E2，28 ng/ml，▾）的数据。结果表示为平均值±标准差。从一个培养基中分离出三个重复的微孔，并显示了一个代表性培养基。

  • 图2
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    图2

    TER与claudin-11 mRNA表达的关系。构建了所有治疗组（单独培养基（○）、FSH（•）、T（△）、FSH+T（△。在整个数据集中观察到显著的相关性（A）(第页=0.534,P（P）< 0.01,n个=32），也适用于T治疗组（B）(第页=0.790，P（P）< 0.02,n个=8).

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    图3

    雄激素治疗对脊髓间细胞接触时克劳丁-11和闭塞素定位的影响在体外支持细胞在Matrigel-coated双腔培养箱中培养，培养条件为基础条件（单独培养基）、（A–C和I组）或添加睾酮（28 ng/ml，E–G和J组），培养时间段如图所示（天）。然后用TO-PRO-3碘化物核复染（红染）对claudin-11（面板A-G）或clodin（面板I-J；绿色染色）进行共聚焦免疫荧光染色。通过用等效浓度的非特异性兔IgG替代每个一级抗体来评估非特异性结合（D组用于claudin-11，K组用于clodin）。棒材=10μm。用免疫组化所用的相同一级抗体，以及在睾酮存在下培养5-7天的细胞提取物，对克劳丁-11（H组）或闭塞素（L组）进行蛋白质印迹检测。

  • 图4
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    图4

    雄激素受体拮抗剂氟他胺对TER和克劳丁mRNA表达和蛋白定位的影响。如图1图例所示，在单独培养基（A）或睾酮（28 ng/ml，B）存在下培养支持细胞并且每天进行TER测量。第5天，将每组细胞清洗并置于含有氟他胺（28μg/ml；•或▪) 如垂直虚线所示，持续4天。开放符号（○，□）表示仅在培养基中或培养基中加睾酮且未接受氟他胺治疗的细胞。第9天，取出氟他胺，将细胞放回单独培养基或培养基加睾酮（28 ng/ml），直到第13天培养结束。如箭头所示，进行了常规介质更换。在第0天、第5天、第9天和第13天，去除细胞，提取总RNA进行RT和实时PCR。面板C显示了单独用培养基（○）或睾酮（□）连续处理的细胞的claudin-11 mRNA表达数据，以及对照（•）或睾酮处理的细胞的数据(▪), 在第5天到第9天接受氟他胺治疗。数据表示为平均值±标准差。(n个=3 PCR估计值），星号表示与单向方差分析和Newman–Keuls确定的各自对照组相比存在显著差异临时的分析测试(*P（P）<0.05**P（P）<0.01，ns，不显著）。a对b；P（P）<0.01，c对d；纳秒。如图2所示，对claudin-11进行免疫组织化学与氟他胺培养并在第9天取样的睾酮处理细胞图例（面板D，相当于▪ B组第9天），或睾酮替代后的细胞，并在第13天取样（E组，相当于▪ 第13天，面板B）。

图1

激素处理对椎间紧密连接通透性和紧密连接蛋白mRNA表达的影响在体外（A）从第0天开始，每天测量支持细胞上皮的跨上皮电阻（TER）。支持细胞（1.25×106细胞/厘米2)在基础条件下（单独培养基，○）或在FSH（2.35IU/ml；•）、睾酮（T；28ng/ml；△）或T（28ng/ml）+FSH（2.35IU/ml，如箭头所示（↓），每隔2天更换培养基和处理液。第3天，用低渗溶液处理所有细胞，以去除污染的生殖细胞。结果表示为平均值±标准差。一个培养基中有三个重复的微孔，显示了三个培养基的代表性。通过单向方差分析（ANOVA）和纽曼-凯尔斯（Newman-Keuls），星号表示每一天与基础培养物的显著差异临时的分析测试(*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01). （B） 实时PCR检测培养的支持细胞（1.25×10）中Claudin-11 mRNA表达和（C）cloddin mRNA表达6细胞/厘米2)在Matrigel-coated塑料24孔培养板中进行处理，如（A）所述。还包括在（B）中添加雌二醇（E2，28 ng/ml，▾）的数据。结果表示为平均值±标准差。从一个培养基中分离出三个重复的微孔，并显示了一个代表性培养基。
图2

TER与claudin-11 mRNA表达的关系。构建了所有治疗组（单独培养基（○）、FSH（•）、T（△）、FSH+T（△。在整个数据集中观察到显著的相关性（A）(第页=0.534,P（P）< 0.01,n个=32），也适用于T治疗组（B）(第页=0.790,P（P）< 0.02,n个=8).
图3

雄激素治疗对支持细胞间接触处claudin-11和occludin定位的影响在体外支持细胞在Matrigel-coated双腔培养箱中培养，培养条件为基础条件（单独培养基）、（A–C和I组）或添加睾酮（28 ng/ml，E–G和J组），培养时间段如图所示（天）。然后用TO-PRO-3碘化物核复染（红染）对claudin-11（面板A-G）或clodin（面板I-J；绿色染色）进行共聚焦免疫荧光染色。通过用等效浓度的非特异性兔IgG替代每个一级抗体来评估非特异性结合（D组用于claudin-11，K组用于clodin）。棒材=10μm。用免疫组化所用的相同一级抗体，以及在睾酮存在下培养5-7天的细胞提取物，对克劳丁-11（H组）或闭塞素（L组）进行蛋白质印迹检测。
图4

雄激素受体拮抗剂氟他胺对TER和克劳丁mRNA表达和蛋白定位的影响。支持细胞在单独培养基（A）或睾酮（28 ng/ml，B）存在下培养，如图1图例所述每天进行TER测量。第5天，将每组细胞清洗并置于含有氟他胺（28μg/ml；•或▪) 如垂直虚线所示，持续4天。开放符号（○，□）表示仅在培养基中或培养基中加睾酮且未接受氟他胺治疗的细胞。第9天，取出氟他胺，将细胞放回单独培养基或培养基加睾酮（28 ng/ml），直到第13天培养结束。如箭头所示，进行了常规介质更换。在第0天、第5天、第9天和第13天，去除细胞，提取总RNA进行RT和实时PCR。C组显示了单独培养基（○）或睾酮（□）连续处理细胞的claudin-11 mRNA表达数据，以及对照（•）或睾丸激素处理细胞的数据(▪), 在第5天到第9天接受氟他胺治疗。数据以平均值±表示标准差。(n个=3 PCR估计值），星号表示与单向方差分析和Newman–Keuls确定的各自对照组相比存在显著差异临时的分析测试(*P（P）<0.05**P（P）<0.01，ns，不显著）。a对b；P（P）<0.01，c对d；纳秒。如图2所示，对claudin-11进行免疫组织化学与氟他胺培养并在第9天取样的睾酮处理细胞图例（面板D，相当于▪ B组第9天），或睾酮替代后的细胞，并在第13天取样（E组，相当于▪ 第13天，面板B）。

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  • Wang RS、Yeh S、Chen LM、Lin HY、Zhang C、Ni J、Wu CC、di Sant’Agenese PA、deMesy-Bentley KL、Tzeng CR等。2006支持细胞中的雄激素受体对于生殖细胞的培育和小鼠睾丸连接复合体的形成至关重要。内分泌学 147 5624–5633.

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  • Xia W、Mruk DD、Lee WM和Cheng CY2005精子发生过程中的细胞因子和连接重构——从睾丸中吸取的教训。细胞因子和生长因子综述 16 469–493.

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