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.1998年7月27日；142(2):573-86.
doi:10.1083/jcb.142.573。

整合素介导的信号受GTPases rho家族成员调控

E A克拉克 1, W G国王, J S布鲁格, M西蒙斯, R O海恩斯
附属公司

整合素介导的信号受GTPases rho家族成员调控

E A克拉克等。 J细胞生物学. .

摘要

肌动蛋白细胞骨架的组织可由可溶性因子调节，这些可溶性因子可触发涉及GTPases Rho家族的信号转导事件。由于粘附相互作用也能够组织基于肌动蛋白的细胞骨架，因此我们利用这些GTPase的显性-抑制突变体，研究了Cdc42-、Rac-和Rho-依赖性信号通路在整合素介导的粘附和细胞扩散过程中调节细胞骨架的作用。当Rat1细胞最初粘附于细胞外基质蛋白纤维连接蛋白时，细胞外围形成点状局灶复合物。在形成局灶复合物的同时，我们观察到局灶黏附激酶（FAK）和Src的一些磷酸化，这些磷酸化独立于Rho家族GTPases发生。然而，随后FAK和paxillin的磷酸化以Rho依赖的方式发生。此外，我们发现肌动蛋白应力纤维辐射的大焦点粘连的组装依赖于Rho。纤维连接蛋白的初始粘附也刺激膜皱褶；我们证明了这种皱褶与Rho无关，但同时依赖于Cdc42和Rac。此外，我们观察到Cdc42控制细胞外信号调节激酶2和Akt的整合素依赖性激活，Akt是一种活性依赖于磷脂酰肌醇（PI）3-激酶的激酶。由于PI 3-激酶可以刺激Rac依赖性膜皱褶，因此Cdc42、PI 3-激酶和Rac似乎位于一条不同的途径上，调节粘连诱导的膜皱折。与Cdc42、Rac和Rho对整合素介导信号的差异调节相反，我们观察到所有三种GTPase都调节细胞扩散，这一事件可能间接控制细胞结构。因此，由GTPases Rho家族不同成员调节的几个可分离的信号通路汇聚在一起，控制细胞骨架组织中的粘附依赖性变化，即调节细胞形态和行为的变化。

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数字

图1
图1
Rat1成纤维细胞在纤维连接蛋白上的粘附和扩散过程中，局部粘附和应力纤维的组装。缺乏血清的Rat1成纤维细胞(a–d)或表达显性抑制性Cdc42的细胞(e–h)，机架1(I–L型)，或RhoA(m–q（平方米）)进行胰蛋白酶消化、清洗，然后将其重新放置在涂有纤维连接蛋白的盖玻片上15次(一,b条,e（电子）,（f）,我,j个,米、和n个)或60(c（c）,d日,克,小时,k个,我,第页、和q个)min并染色以检测病毒(b条,d日,（f）,小时,j个,我,n个、和q个)和F-actin(一,c（c）,e（电子）,克,我,k个,米、和第页). 棒材，10μm。
图2
图2
PDGF和血清在血清饥饿的粘附性Rat1细胞中诱导膜褶皱和应力纤维的组装。父母(a–c)，主导-禁止Rac-(d日)，或Rho表达(e（电子）)将Rat1细胞在无血清培养基中铺板在纤连蛋白包被的盖玻片上48小时。然后不处理细胞(一)或用PDGF-BB刺激(b条和d日; 3纳克/毫升）或FBS（1%，c（c）和e（电子）)在37°C下保持10分钟。然后对细胞进行清洗、固定、渗透，然后用阴茎倍体素对应激纤维中的F-actin进行染色。棒材，10μm。
图3
图3
Rho家族成员Cdc42、Rac1和RhoA显性抑制突变体在Rat1细胞中的表达。Rat1成纤维细胞（lane1)或表达Myc表位的细胞–标记为N17Cdc42（lane2)，N17Rac1（车道三)或N19RhoA（车道4)在不含2 ng/ml四环素的条件下培养48 h，用Myc表位抗体（9E10）免疫印迹法检测这些蛋白的表达。
图4
图4
Rat1细胞需要Rho、Rac和Cdc42才能在纤维连接蛋白上扩散。缺乏血清的父母(比率1)或主要禁止Cdc42-(N17Cdc42型)，机架1-(N17Rac型)，或RhoA-表达(N19Rho号)将大鼠1成纤维细胞进行胰蛋白酶化、清洗，然后将其重新放置在纤维连接蛋白或聚赖氨酸涂层的微孔上20分钟。然后固定细胞并用结晶紫染色。拍摄细胞的随机区域，并确定细胞扩散的百分比。误差条表示一式三份样品的标准偏差。在三个单独的实验中也得到了类似的结果。（学生的t吨-试验：N17Cdc42，P（P）< 0.01; N17Rac，P（P）< 0.02; N19Rho、，P（P）< 0.1)
图5
图5
粘附纤维连接蛋白的Rat1细胞中F-actin含量的定量。血清缺乏的父母(比率1)或主要禁止Cdc42-(N17Cdc42型)、Rac1-（N17Rac）或RhoA-表达(N19Rho号)将大鼠1成纤维细胞胰蛋白酶化、清洗，然后将其重新放置在纤维连接蛋白涂层的孔上15或60分钟。然后固定细胞并对其进行类固醇染色，并按照材料和方法中的描述对类固醇结合量进行量化。通过将纤维连接蛋白粘附细胞中结合的卵磷脂数量除以15分钟时纤维连连接蛋白附着Rat1细胞中结合卵磷脂的数量来确定相对F-actin含量。误差条表示三份样品的标准偏差。在三个单独的实验中获得了类似的结果。
图6
图6
Cdc42、Rac和Rho在Rat1成纤维细胞中的局灶性粘连和应力纤维组装中的作用。用10μg编码Myc-N17Cdc42的pCMV质粒转染Rat1细胞(a–d)或Myc-N17Rac1(e–h)或用C3转移酶处理的Rat1细胞(我和j个)如材料和方法中所述，对其进行胰蛋白酶消化、清洗，然后将其重新放置在涂有纤维连接蛋白的盖玻片上60分钟，并对其进行F-actin染色(一,e（电子）、和我)，β1整合素(c（c）和克)，文丘林(j个)，或Myc表位标签(b条,d日,（f）、和小时).
图7
图7
Rho在整合素介导的FAK酪氨酸磷酸化中的作用。在一和B类，缺乏血清的父母(比率1)或主要禁止Cdc42-(N17Cdc42型)，种族1-(N17Rac型)，或RhoA-表达(N19Rho号)对大鼠1成纤维细胞进行胰蛋白酶消化、清洗，然后将其重新放置在纤维连接蛋白涂层孔上0、10、30或90分钟C类，用C3转移酶处理Rat1细胞(+C3类)如材料和方法中所述，使用并电镀0、30或90分钟。然后对细胞进行裂解，用FAK的多克隆抗血清对50μg裂解产物进行免疫沉淀，进行电泳，然后用抗磷酸酪氨酸抗体进行免疫印迹(一和C类)或抗FAK抗体(B类). 这里给出的结果代表了八个单独的实验。
图8
图8
Rho和Cdc42在整合素介导的帕西林酪氨酸磷酸化中的作用。在一和B类，血清缺乏的父母(比率1)或主要禁止Cdc42-(N17Cdc42型)，机架1-(N17Rac型)，或RhoA-表达(N19Rho号)对大鼠1成纤维细胞进行胰蛋白酶消化、清洗，然后将其重新放置在纤维连接蛋白涂层孔上0、10、30或90分钟C类、未经处理的Rat1细胞（−）或经C3转移酶处理的Rat2细胞(+C3类)如材料和方法中所述，使用并电镀0或30分钟。然后对细胞进行裂解，用paxillin单克隆抗体对100μg裂解产物进行免疫沉淀，进行电泳，然后用抗磷酸酪氨酸抗体进行免疫印迹(一和C类)或抗帕西林抗体(B类).
图9
图9
Rho和Cdc42在整合素介导的Erk2酪氨酸磷酸化中的作用。在一，缺乏血清的父母(比率1)或主要禁止Cdc42-(N17Cdc42型)，机架1-(N17Rac型)，或RhoA-表达(N19Rho号)对大鼠1成纤维细胞进行胰蛋白酶消化、清洗，然后将其重新放置在纤维连接蛋白涂层孔上0、10、30或90分钟B类将Rat1或N17Cdc42表达细胞在纤维连接蛋白上替换0、15或60分钟，或在室温下用10 ng/ml PDGF悬浮处理5分钟。在C类，用C3转移酶处理Rat1细胞(+C3类)如材料和方法中所述，并接种0、15或60分钟。然后裂解细胞，对15μg裂解物进行电泳并用泛Erk抗体进行免疫印迹。在D类将1μg编码HA-ERK的pSVL质粒单独或与10μg编码Myc-N17Cdc42的pCMV联合转染Rat1细胞。将细胞进行血清饥饿、胰酶消化、洗涤，然后将其重新放置在纤维连接蛋白涂层培养皿上0、15或60分钟。用12CA5抗体从细胞裂解液中免疫沉淀HA-ERK，并使用髓磷脂碱性蛋白进行体外激酶分析(MBP公司)作为基底。用12CA5抗体免疫印迹法检测细胞裂解物（40μg）中的HA-ERK。在单独转染HA-ERK并保持悬浮状态的细胞中，HA-ERK的比活性相对于激酶的比活性表达。
图10
图10
整合素介导的Src酪氨酸磷酸化独立于Cdc42、Rac和Rho。缺乏血清的父母(比率1)或显性抑制性Cdc42-(N17Cdc42型)，机架1-(N17Rac型)，或RhoA-表达(N19Rho号)对Rat1成纤维细胞进行胰蛋白酶化、清洗，然后将其重新放置在纤维连接蛋白涂层孔上0、10、30或90分钟。然后对细胞进行裂解，并对15μg裂解产物进行电泳，并用Src磷酸酪氨酸-416（Y416P）特异性抗体进行免疫印迹(一)或总Src蛋白(B类).
图11
图11
整合素介导的Akt激活依赖于Cdc42。缺乏血清的父母(比率1)或主要禁止Cdc42-(N17Cdc42型)，机架1-(N17Rac型)，或RhoA-表达(N19Rho号)将Rat1成纤维细胞进行胰蛋白酶化、清洗，然后将其重新放置在纤维连接蛋白涂层孔上0、15或60分钟。如材料和方法中所述，使用组蛋白H2B作为底物来测定Akt激酶活性。这张自动放射自显影图代表了三个独立实验的结果。在B类将1μg编码HA-Akt的pCMV-6质粒单独或与10μg编码Myc-N17Cdc42的pCMV质粒联合转染Rat1细胞，将其进行血清饥饿、胰蛋白酶消化、洗涤，然后将其重新放置在纤维连接蛋白包被的培养皿上0、15或60分钟。用抗体（12CA5）免疫沉淀HA-Akt以组蛋白H2B为底物进行体外激酶分析。然后对样品进行电泳并转移到硝酸纤维素膜上进行放射自显影(过氧化氢)并在荧光成像仪上进行量化。然后用12CA5对膜进行探测，以确定免疫沉淀中的HA-Akt水平。HA-Akt的比活性（活性除以蛋白质水平）是相对于单独转染HA-Akts并保持悬浮状态的细胞中激酶的比活性来表达的。
图12
图12
总结Rho家族GTPases、Cdc42、Rac和Rho在调节细胞形态和整合素介导的信号事件中的不同作用。N17Cdc42、N17Rac、N19Rho或C3转移酶完全抑制的能力（>90%，大箭头)，部分抑制（40–70%，小箭头)，在单个时间点禁用(白色箭头)或不显著抑制（<10%，短跑)整合素介导的形态变化和粘附到纤维连接蛋白时发生的信号事件总结于一.B类显示了Rho家族GTPases在整合素介导的调节细胞骨架组织的信号事件中发挥的不同作用的模型。细胞与细胞外基质的粘附诱导整合素受体的小簇聚集，从而通过多种途径形成细胞骨架组织。FAK和Src的初始激活以及焦点复合物的组装独立于Rho家族成员。Rho依赖性途径调节FAK的完全激活、帕西林的磷酸化和局部粘连的组装。来自聚集整合素的第三条途径激活Cdc42依赖性途径中的Akt（可能通过PI 3-激酶）。Cdc42和Rac都调节膜皱褶所需的肌动蛋白组织。粘附依赖性Erk磷酸化取决于Cdc42和Rho的活性，它需要一个适当组织的细胞骨架。Rho、Cdc42和Rac都调节应激纤维中F-actin的组织，尽管它们不太可能通过单一的线性“级联”进行调节，因为一些事件，例如FAK磷酸化，仅由单个Rho家族成员调节。因此，最合理的解释是Rho家族成员通过收敛途径调节粘连引发的应力纤维形成。
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