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.2015年7月10日；23(2):163-77.
doi:10.1089/ars.2013.5825。

牛磺酸氯胺通过上调小鼠巨噬细胞中Nrf2介导的血红素加氧酶-1的表达来刺激胞吐：一氧化碳的可能参与

旺基·金 1, Hoon Ui Kim先生 1, 哈娜·李 1, Seung Hyeon Kim先生 1, Chaekyun Kim先生 2, Young-Nam Cha村 2, Yeonsoo乔 三, 洪大中 三, Jaebong Jang公司 1, Kyeojin Kim先生 1, 杨格苏 1, Hyeon-Ok Jin公司 4, 李金京 4, Young-Joon苏尔 1 5 6
附属公司

牛磺酸-氯胺通过上调Nrf2介导的血红素加氧酶-1在小鼠巨噬细胞中的表达促进胞吐：一氧化碳的可能参与

旺基·金等。 抗氧化剂氧化还原信号. .

摘要

目的：检查牛磺酸-氯胺（TauCl）的促溶作用。

结果：将TauCl注射到小鼠的腹膜中可以提高酵母菌A诱导的腹膜炎的消退。此外，当从腹膜渗出液中获得的巨噬细胞用TauCl处理时，其传出细胞能力提高。在暴露于TauCl的小鼠巨噬细胞样RAW264.7细胞中，吞噬凋亡中性粒细胞的巨噬细胞比例也增加。在这些接受TauCl治疗的巨噬细胞中，血红素氧合酶-1（HO-1）的表达升高，核因子E2相关因子2（Nrf2）的核移位增加。TauCl直接与Kelch-like ECH关联蛋白1（Keap1）结合，这似乎延缓了Keap1驱动的Nrf2降解。这导致Nrf2的核转位稳定和增强，HO-1表达上调。当TauCl作用于从Nrf2或HO-1野生型小鼠分离的腹腔巨噬细胞时，会刺激传出细胞增生（巨噬细胞吞噬凋亡的中性粒细胞），但在Nrf2和HO-1基因敲除小鼠的巨噬细胞中没有。此外，在用TauCl处理的RAW264.7细胞中，识别凋亡细胞表面暴露的磷脂酰丝氨酸的一些清道夫受体的转录表达增加。RAW264.7细胞中HO-1活性的药物抑制或HO-1基因的敲除可消除TauCl诱导的传出细胞作用，而HO-1的过度表达和HO产物一氧化碳（CO）的处理均增强了巨噬细胞的传出细胞活性。

创新：这项工作首次证明TauCl刺激巨噬细胞的胞外作用。这项研究的结果表明，TauCl在炎症性疾病的治疗中具有潜力。

结论：TauCl可以通过Nrf2介导的HO-1上调和随后的CO生成增加巨噬细胞的传出活性，从而促进炎症的解决。

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数字

<b>图1</b>
图1。
TauCl刺激酵母多糖A诱导的小鼠腹膜炎模型中凋亡细胞的传出细胞活性。用酵母多糖A（30 mg/kg）给药12 h的小鼠经腹腔注射载体或TauCl钠盐形式（2或20 mg/kg）。6小时后，收集腹膜渗出液。（A）计算腹膜渗出液中的白细胞总数。（B）通过差异细胞计数测定收集的腹膜渗出液中单核细胞和中性粒细胞的比例。（C）在自发性溶解酵母多糖a诱导的腹膜炎模型中，吞噬PMN的巨噬细胞比例（F4/80+Gr-1组+)流式细胞仪检测。（D）用于测量细胞外吞体外收集酵母多糖A处理小鼠腹腔分泌物中的巨噬细胞，并与相同腹腔分泌液中分离的PMN共同孵育。我们发现巨噬细胞附着在培养板的底部，中性粒细胞呈悬浮状态。在分离附着的巨噬细胞和非附着的凋亡中性粒细胞后，如材料和方法一节所述，测量吞噬凋亡性中性粒细胞的巨噬细胞活性的增加。经TauCl（0.5 m）处理的腹腔巨噬细胞M（M）)与凋亡的腹腔中性粒细胞共同孵育1小时。巨噬细胞吞噬凋亡的中性粒细胞是用抗F4/80的免疫细胞化学方法检测的(绿色; 巨噬细胞标记物）和抗Gr-1(红色; 中性粒细胞标记物）抗体。所有数据代表平均值±标准差(n个=3), *第页<0.05, **第页<0.01，以及***第页<0.001. 多形核细胞；SD，标准偏差；TauCl、牛磺酸氯胺。
<b>图2</b>
图2。
TauCl增加Nrf2和HO-1的表达。（A、B）腹腔巨噬细胞表达Nrf2的比例（A）和HO-1（B）流式细胞术检测。（C、D）用TauCl（0.5 m）处理RAW264.7细胞M（M）)对于指定的时间段。HO-1的mRNA水平（C）和Nrf2（D）通过实时PCR检测。（E）用TauCl处理RAW264.7细胞3h，通过免疫印迹分析检测Nrf2的核转位。拉明B被用作特异性核蛋白标记物。（F）为了验证Nrf2的核转位，在用TauCl处理RAW264.7细胞或腹腔巨噬细胞3小时后，使用Nrf2抗体进行免疫细胞化学分析。细胞用PI和DAPI染色。数据表示平均值±SD(n个=3), *第页<0.05, **第页<0.01，以及***第页<0.001. 所有实验都是用TauCl的钠盐形式进行的，除了左侧面板属于（F）其中RAW264.7细胞用游离形式的TauCl处理。DAPI，4′，6-二氨基-2-苯基吲哚；血红素氧化酶-1；核因子E2相关因子2；聚合酶链式反应；PI，碘化丙啶。
<b>图3</b>
图3。
TauCl诱导的Nrf2活化对巨噬细胞中HO-1的表达及其传出细胞活性很重要。（A）RAW264.7细胞转染打乱或编号2siRNA，然后在没有或存在0.5 m的条件下培养M（M）TauCl（钠盐）9小时。（B）从Nrf2野生型和Nrf2基因敲除小鼠的腹腔巨噬细胞中收集巨噬细胞，并用TauCl（钠盐）处理3 h。通过免疫细胞化学分析测定Nrf2的核移位。（C、D）用TauCl（钠盐）处理从Nrf2野生型和Nrf2基因敲除小鼠获得的腹腔巨噬细胞或MEF 9小时。通过Western blot分析测定HO-1和Nrf1蛋白水平。肌动蛋白被用作标准化的等负荷对照。数据表示平均值±SD(n个=3), *第页<0.05, **第页<0.01.（E）对于体外细胞外效应试验，收集经TauCl（钠盐）处理18 h的Nrf2野生型和敲除小鼠的腹腔巨噬细胞，并与凋亡中性粒细胞共同孵育1 h。用F4/80抗体免疫染色法测定巨噬细胞摄取凋亡PMN的情况(绿色; 巨噬细胞标志物）和抗Gr-l(红色; 中性粒细胞标记物）。典型的荧光显微照片显示巨噬细胞(绿色)吞噬凋亡中性粒细胞(红色). 吞噬凋亡中性粒细胞的巨噬细胞如图所示星罗棋布的正方形。MEF，小鼠胚胎成纤维细胞；小干扰RNA。
<b>图4</b>
图4。
TauCl似乎直接与Keap1结合，从而减少Nrf2与Keap1。（A、B）用DTT（0.5 m）处理RAW264.7细胞M（M）)用0.5米孵育前1小时M（M）TauCl（钠盐）额外3小时（A）或9小时（B）Nrf2的蛋白质水平（A）和HO-1（B）通过Western blot分析测定。数据表示平均值±SD(n个=3), *第页<0.05, **第页<0.01.（C）用RT-PCR测定HO-1 mRNA水平。（D）为了确定TauCl是否能直接与Keap1结合，RAW264.7巨噬细胞裂解物与单独的Sepharose 4B珠或TauCl-结合的Sepharo 4B珠孵育，并通过免疫印迹分析来分析下拉蛋白。（E）为了确定TauCl是否能破坏Keap1-Nrf2复合物，对来自TauCl-处理的RAW264.7巨噬细胞的细胞裂解物进行免疫沉淀分析。（F）为了评估TauCl处理的RAW264.7巨噬细胞中Nrf2的蛋白酶体降解，对细胞裂解物进行泛素化分析。DTT，二硫苏糖醇；Keap1、Kelch样ECH结合蛋白1；RT-PCR，逆转录-聚合酶链反应。
<b>图5：</b>
图5：。
ZnPP对HO的抑制减弱Tau-Cl的促溶作用。在20 mg/kg TauCl（钠盐）治疗前2 h，用酵母多糖A（30 mg/kg）给药小鼠12 h，一次性腹腔注射ZnPP（25 mg/kg）或一种载体。6小时后，收集腹膜渗出液。（A）收集的腹膜渗出液中的单核细胞和中性粒细胞的比例通过差异细胞计数确定。（B）在酵母多糖引发的腹膜炎模型中，巨噬细胞摄取PMN的比例（F4/80+等级-1+)流式细胞仪检测。（C）用ZnPP（10μM（M）)在用0.5 m培养之前培养1小时M（M）TauCl（钠盐）再培养18小时。然后将细胞与FITC-膜联蛋白V染色的凋亡Jurkat T细胞共同培养1小时。典型的流式细胞术点图中显示吞噬FITC-膜联蛋白-V的Jurkat T细胞凋亡的巨噬细胞百分比的变化。数据表示平均值±SD(n个=3), *第页<0.05, **第页<0.01, ***第页<0.001. 异硫氰酸荧光素；ZnPP，锌原卟啉IX。
<b>图6</b>
图6。
TauCl诱导的HO-1对于刺激巨噬细胞的胞吐至关重要。（A）RAW264.7细胞转染打乱或HO-1型siRNA 16小时，然后用TauCl（钠盐）再处理18小时。（B）用pcDNA-mock或pcDNA-HO-1转染RAW264.7细胞24小时。（C）用于测量体外用F4/80抗体免疫细胞化学检测巨噬细胞吞噬凋亡的中性粒细胞(绿色; 巨噬细胞标记物）和抗Gr-1(红色; 中性粒细胞标记物）抗体。材料和方法部分描述了实验过程和其他细节。数据表示平均值±SD(n个=3), **第页<0.01, ***第页<0.001. pcDNA，质粒构建DNA；PE，藻红蛋白。
<b>图7</b>
图7。
比较TauCl及其亲本化合物牛磺酸诱导细胞外化和HO-1表达的能力。（A）0.5 m处理的RAW264.7细胞M（M）将TauCl或相同浓度的牛磺酸与FITC-膜联蛋白-V染色的凋亡Jurkat T细胞共同孵育18 h。代表性流式细胞术点图中显示吞噬FITC-膜联蛋白-V的Jurkat T细胞凋亡的巨噬细胞百分比的变化。（B、C）用TauCl或牛磺酸处理RAW264.7细胞6小时（B）或9小时（C）分别用实时定量PCR和Western blot分析测定HO-1的mRNA和蛋白水平。数据代表平均值±标准差(n个=3), *第页<0.05, ***第页<0.001. 除了图2C中的数据外，所有实验都是用游离形式的TauCl进行的，其中细胞是用钠盐形式的Tau Cl处理的。要查看此彩色插图，请参阅本文的web版本，网址为网址：www.liebertpub.com/ars
<b>图8</b>
图8。
TauCl通过上调识别凋亡细胞的一些清道夫受体的表达来增加巨噬细胞的传出细胞活性。（A）RAW264.7细胞与CFSE标记的凋亡Jurkat T细胞在没有或存在annexin V的情况下共同孵育。1小时后，通过流式细胞仪检测细胞。（B）RAW264.7细胞用0.5 mM（M）指定时间段的TauCl（钠盐）。mRNA水平BAI-1、MerTK、，和时间4通过实时PCR检测。（C）RAW264.7细胞转染打乱或HO-1型siRNA，然后在没有或存在TauCl的情况下培养。mRNA水平BAI-1号机组通过RT-PCR测定(左侧面板)和定量实时PCR(右侧面板).（D）流式细胞术检测RAW264.7细胞中含有FITC-膜联蛋白V的凋亡Jurkat T细胞。（D）RAW264.7细胞，用TauCl（钠盐）或TauCl+Hb（10μM（M）)与FITC-annexin-V保存的Jurkat T细胞共同孵育18 h，再孵育1 h。（E）RAW264.7细胞用CORM-2处理18 h，并与FITC-膜联蛋白-V染色的凋亡Jurkat T细胞共同孵育1 h。数据表示平均值±标准偏差(n个=3), *第页<0.05, **第页<0.01，以及***第页<0.001.BAI-1号机组，脑特异性血管生成抑制剂1；CFSE，羧基荧光素丁二酰亚胺酯；CORM-2，CO-释放分子-2；血红蛋白；MerTK，c公司-梅尔原癌基因酪氨酸激酶；时间4、T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域分子4。要查看此彩色插图，请参阅本文的web版本，网址为www.liebertpub.com/ars
<b>图9</b>
图9：。
TauCl对炎症消退作用的潜在机制。TauCl是炎症条件下中性粒细胞内源性生成的。在炎症消退过程中，激活的中性粒细胞产生并随后释放TauCl，通过Nrf2介导的HO-1表达上调，增强巨噬细胞的传出活性。HO-1衍生的CO生成可能在TauCl诱导的炎症消退过程中介导传出细胞增生。一氧化碳。要查看此彩色插图，请参阅本文的web版本，网址为www.liebertpub.com/ars
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