Characteristics of the cation cotransporter NKCC1 in human brain: alternate transcripts, expression in development, and potential relationships to brain function and schizophrenia

doi:10.1523/JNEUROSCI.1423-13.2014

.2014年4月2日；34(14):4929-40.

doi:10.1523/JNEUROSCI.1423-13.2014。

人脑阳离子共转运体NKCC1的特征：替代转录物、发育中的表达以及与脑功能和精神分裂症的潜在关系

盛田由纪香¹, 约瑟夫·H·卡利科特, 劳伦·R·特斯塔, 米歇尔一世Mighdoll, 德怀特·迪金森, Qiang Chen（陈强）, 冉涛, 芭芭拉·利普斯卡, Bhaskar Kolachana公司, 阿曼达·J·劳, 天章业, 理查德·斯特劳布, 丹尼尔·温伯格, 乔尔·克莱曼, 托马斯·海德

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¹日本广岛县广岛市广岛市医院精神病学科，马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家心理健康研究所，壁内研究项目部，基因、认知和精神病临床脑疾病科，邮编：20892，邮编：730-8518，利伯大脑发育研究所，约翰霍普金斯医学院，马里兰州巴尔的摩，邮编：21205，科罗拉多州奥罗拉市科罗拉多大学医学院精神病学系、细胞和发育生物学系，神经发育和神经精神遗传学实验室，邮编：80045，精神病学系，神经病学系，马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院神经科学和麦库西克·纳桑遗传医学研究所，邮编：21205。

PMID： 24695712
预防性维修识别码：项目经理3972720
内政部： 10.1523/JNEUROSCI.1423-13.2014

人脑阳离子共转运体NKCC1的特征：替代转录物、发育中的表达以及与脑功能和精神分裂症的潜在关系

盛田由纪香等。神经科学. 2014.

.2014年4月2日；34(14):4929-40.

doi:10.1523/JNEUROSCI.1423-13.2014。

作者

盛田由纪香¹, 约瑟夫·卡利科特, 劳伦·R·特斯塔, 米歇尔·米格多尔, 德怀特·迪金森, Qiang Chen（陈强）, 冉涛, 芭芭拉·利普斯卡, Bhaskar Kolachana公司, 阿曼达·J·劳, 天章业, 理查德·斯特劳布, 丹尼尔·温伯格, 乔尔·克莱曼, 托马斯·M·海德

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¹日本广岛县广岛市广岛市医院精神病学科，马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家心理健康研究所，壁内研究项目部，基因、认知和精神病临床脑疾病科，邮编：20892，邮编：730-8518，利伯大脑发育研究所，约翰·霍普金斯医学院，马里兰州巴尔的摩21205，科罗拉多大学医学院精神病学系、细胞与发育生物学系神经发育与神经精神遗传学实验室，科罗拉多州奥罗拉80045，以及精神病学系、神经病学系，马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院神经科学和麦库西克·纳桑遗传医学研究所，邮编：21205。

PMID： 24695712
预防性维修识别码：项目经理3972720
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摘要

在发育早期，GABA是成年人的一种抑制性神经递质，具有兴奋性。NKCC1（SLC12A2）编码两个阳离子氯共转运体之一，介导GABA从兴奋性转化为抑制性。使用3'和5'RACE和PCR，我们验证了先前表征的NKCC1a（1-27）和NKCC1b（1-27（Δ21））的替代转录物，鉴定了新的NKCC1转录物，并探索了它们在人类前额叶皮层发育过程中的表达模式。一种新的超短转录物（1-2a）优先在胎儿中表达。与对照组相比，精神分裂症患者NKCC1b和1-2a的表达减少（NKCC1b:0.8倍减少，p=0.013；1-2a:0.8倍降低，p=0.006）。此外，NKCC1b的表达与NKCC1多态性rs3087889相关。rs3087889处的次要等位基因与NKCC1b表达降低相关（主要等位基因纯合子：N=37；次要等位蛋白纯合子；N=15；减少1.5倍；p<0.01），也与病例对照样本中精神分裂症风险的适度增加相关（对照组：N=435；病例组：N=397，OR=1.5）。随后发现，该等位基因与工作记忆任务期间BOLD fMRI测量的与精神分裂症工作记忆（Cohen’s d=0.35）、整体认知或g（d=0.18）和前额叶低效（d=0.36）相关的认知（n=369）和fMRI（n=313）中间表型相关。总之，这些临床前和临床结果表明，NKCC1的变异可能通过分子水平上mRNA表达的改变和宏观或系统水平上最佳前额叶功能的损害增加精神分裂症的风险。

关键词：GABA；NKCC1；mRNA；神经递质；精神分裂症；抄本。

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数字

**图1。**
RACE鉴定的人类NKCC1基因5′端和3′端结构示意图。图的顶部显示了人类NKCC1基因（全长亚型NKCC1a）的基因组组织，以及指示转录方向的水平箭头。连续线表示基因组序列，NKCC1的已知外显子显示为矩形并编号。新识别的外显子2a和4a显示为小矩形。5′和3′RACE产物中包含的外显子用实线连接的方框表示。RACE检测到一个备选第一外显子和10个备选终止外显子（NKCC1外显子2a、4a和27）。

**图2。**
人类NKCC1基因选择性剪接变异体的基因组组织示意图。图的顶部显示了人类NKCC1基因（亚型NKCC1a）的基因组组织，以及指示转录方向的水平箭头。连续线表示基因组序列，NKCC1的已知外显子显示为矩形并编号。新的外显子（外显子2a位于内含子2，4a位于内含物4，21a位于内含体21）显示为小矩形。一个椭圆形代表从NKCC1外显子1开始的ORF终止密码子的位置；开放的卵圆形表示提前终止密码子（PTC）；闭合的椭圆表示正常的终止密码子。使用Compute pI/MW工具计算从NKCC1外显子1内的第一个起始密码子到正常终止密码子或PTC的每个蛋白质亚型的预测分子量(http://www.expasy.org/tools/pi_tool.html)并显示在MW栏下。转染实验中使用的变体用星号标记。

**图3。**
使用抗Myc抗体通过Western blotting检测蛋白质。从转染NKCC1变体的HEK293细胞中获得蛋白质提取物。一、NKCC1a（外显子1–27）、NKCC1 b（外显子1–27（Δ21））、1–4a（外显子1–4a）和1–2a（外隐子1–2a）。b条，使用蛋白质提取试剂盒纯化NKCC1蛋白质。我们用含有以下NKCC1变体的Myc-fusion构建物转染HEK293细胞：NKCC1a（外显子1-27）、NKCC1b（外显字1-27、Δ21）、1-4a和1-2a。然后，我们将这些蛋白质分为五等分：总蛋白、细胞质蛋白、核蛋白、膜蛋白和细胞骨架蛋白。我们检测了NKCC1a（外显子1–27）、NKCC1b（外显字1–27，Δ21）和1–4a亚型在细胞质和膜组分中的蛋白质。然而，1–2a蛋白仅在细胞质部分中发现。***c（c）***，我们用不同的细胞，人类SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞证实了这些结果。

**图4。**
NKCC1转录物在人类前额叶皮层的表达贯穿整个生命周期，从妊娠第14周到第20周，以及从出生（0）到老年。年龄在x个-轴线；相对表达式级别位于年-轴。每个点代表一个主题；蓝色钻石代表了黄土的契合。一，NKCC1a（1-27）。b条，NKCC1b（1–27（Δ21））。***c（c）***，1-27（21a）。d日，1-4a。***e（电子）***，1-2a。超短NKCC1转录物（1-2a）在胎儿前额叶皮层中优先表达(***e（电子）***).

**图5。**
精神分裂症患者和非精神病对照者DLPFC中NKCC1转录物的表达。精神分裂症患者DLPFC中NKCC1b（1–27（Δ21））（*）和1–2a（**）mRNA的表达显著降低（NKCC1b:N个= 48; 1–2a：N个=45）与对照组（NKCC1b：N个= 47; 1–2a：N个= 44) (b条,***e（电子）***). 精神分裂症患者DLPFC中NKCC1a（1-27）、1-27（21a）和1-4a转录物的表达没有差异（NKCC1a:N个= 45; 1–27:N个= 44; 1-4a：N个=45）与对照组（NKCC1a：N个= 48; 1–27:N个= 47; 1-4a：N个= 48) (一,***c（c）***,d日).

**图6。**
精神分裂症患者和非精神病对照者DLPFC中NKCC1转录物的表达。我们分别检测了黑人组（AA）和白人组（CAUC）的表达水平，并将对照组与精神分裂症患者进行了比较。在黑人队列中，精神分裂症患者的DLPFC中NKCC1b（1-27（Δ21））（**）、1-27（21a）（*）、1-4a（*）和1-2a（*N个= 28; 1–27:N个= 27; 1-4a：N个= 28; 1–2a：N个=27）与对照组（NKCC1b：N个= 31; 1–27:N个= 30; 1-4a：N个= 31; 1–2a：N个= 30) (***b–e类***). 在白人队列中，精神分裂症患者的1–2a亚型也显著降低(N个=17）与对照组相比(N个= 14) (*) (***e（电子）***). NKCC1b的表达没有差异（1–27（Δ21））（对照组：N个= 15; 精神分裂症：N个=17），1–27（21a）（对照：N个= 15; 精神分裂症：N个=17）和1-4a（对照：N个= 15; 精神分裂症：N个=17）白人队列中的转录物(***b–d段***). 在两个黑人队列中，NKCC1a（1-27）的表达没有显著差异（对照组：N个= 32; 精神分裂症：N个=28）或白人队列（对照组：N个= 15; 精神分裂症：N个= 17) (一).

**图7。**
精神分裂症患者和正常对照者DLPFC中NKCC1转录物的表达。我们检测了10个NKCC1 SNP与NKCC1剪接变异体mRNA表达水平的相关性。所有数据均按死亡年龄、pH值、RIN和性别进行协整。NKCC1a（1-27）和NKCC1b（1-27（Δ21））的mRNA表达与rs12189448显著相关：小（C）等位基因携带者（NKCC1a:N个= 82; NKCC1b：N个=81）与主要（A）等位基因纯合个体（NKCC1a:N个= 12; NKCC1b：N个= 12) (*). 此外，rs3087889与NKCC1b（1-27（Δ21））的表达呈剂量依赖性显著相关。特别是，rs3087889的微小等位基因（A）纯合子个体(N个=15）的主要等位基因（T）的表达明显低于纯合子(N个= 37) (第页< 0.01) (**). 按种族划分的rs3087889的基因型和等位基因频率见6。

**图8。**
NKCC1 rs3087889预测健康对照组在工作记忆任务中前额叶效率低下。携带NKCC1 rs3087889的次要等位基因（A）的健康个体与mRNA表达和精神分裂症风险相关，在N个-通过BOLD fMRI分析背部工作记忆任务。我们比较了186名NKCC1 T/T受试者和127名NCCC1 A携带者，他们在年龄、性别、WAIS-IQ、，N个-反作用时间，以及N个-反演出(第页> 0.05). 我们校正了BOLD fMRI结果中的小体积和家族性错误（SVC，FWE）：第页考虑到我们先前关于前额叶皮层激活差异（效率）和尸检位置的假设，<0.05。为了便于说明，我们在此处显示结果第页<0.01和任意单位（au）。

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