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.2014年2月18日；111(7):2554-9.
doi:10.1073/pnas.1312570111。 Epub 2014年2月3日。

肿瘤抑制因子LKB1的缺失通过HIF-1α促进癌细胞的代谢重编程

布兰登·福伯特 1, 艾玛·E·文森特, 塔克拉·格里斯, 博泽纳·桑博尔斯卡, 伊兹雷格说, 罗伯特·U·斯文森, 奥瓦尔·A·马默, 戴娜·阿维佐尼斯, 大卫·B·沙克尔福德, 鲁本·J·肖, 罗素·G·琼斯
附属公司

肿瘤抑制因子LKB1的缺失通过HIF-1α促进癌细胞的代谢重编程

布兰登·福伯特等。 美国国家科学院程序. .

摘要

与细胞转化相关的主要代谢变化之一是提高了营养素的利用率，通过促进能量生产和提供生物合成中间体促进肿瘤的发展。肝激酶B1（LKB1）是一种丝氨酸/苏氨酸激酶和肿瘤抑制剂，通过调节哺乳动物雷帕霉素靶点（mTOR）活性，将生物能量学与细胞生长控制结合起来；然而，LKB1对肿瘤代谢的影响尚不明确。在这里，我们表明LKB1的丢失在增殖细胞中诱导了一个进行性代谢程序。缺乏LKB1的细胞显示出葡萄糖和谷氨酰胺的吸收和利用增加，这支持细胞ATP水平和大分子生物合成增加。这种LKB1依赖性的细胞代谢重编程依赖于缺氧诱导因子-1α（HIF-1α），HIF-1α在正常氧下在LKB1缺陷细胞中积累，并被mTOR复合物I信号传导的抑制所拮抗。沉默HIF-1α可逆转LKB1信号减少带来的代谢优势，并在低营养条件下损害LKB1缺陷肿瘤细胞的生长和存活。总之，我们的数据表明，肿瘤抑制因子LKB1通过调节HIF-1α依赖的代谢重编程，作为肿瘤代谢和生长控制的中央调节器。

关键词：HIF-1α；PJS；Peutz-Jeghers综合征；华伯格效应；肿瘤代谢；谷氨酰胺代谢。

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利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
LKB1的缺失促进了葡萄糖和谷氨酰胺代谢的增强。(A类)LKB1裂解物上的LKB1免疫印迹飞行/飞行用对照逆转录病毒（Cre−）或表达Cre重组酶（Cre+）的逆转录病毒转导的MEF。(B类和C类)LKB1-缺陷MEF的葡萄糖和谷氨酰胺消耗。LKB1号机组飞行/飞行将表达空载体（开条）或Cre重组酶（填充条）的MEF培养72小时，并消耗葡萄糖(B类)和谷氨酰胺消耗(C类)酶法测定。(D类和E类)电子卡(D类)和OCR(E类)用于LKB1飞行/飞行有（+）或无（−）Cre表达的MEF。(F类)LKB1-缺陷MEF产生的乳酸。细胞被视为B类通过酶法测定培养液中的细胞外乳酸。(G公司–我)LKB1-null MEF对葡萄糖和谷氨酰胺的代谢过程。LKB1-满（填充棒）或控制（开放棒）MEF脉冲13C-葡萄糖或13C-谷氨酰胺1小时，以及13C并入乳酸(G公司)，谷氨酸(H（H）)和α-酮戊二酸(我)通过GC-MS测定*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01.
图2。
图2。
LKB1缺乏的肿瘤细胞表现出更强的糖酵解和TCA循环流量。(A类)空载体（Vec）或LKB1 cDNA转导的A549细胞裂解物上的LKB1免疫印迹。(B类)表达空载体（填充条）或LKB1 cDNA（开放条）的A549细胞的ECAR和OCR。(C类)来源于13GC-MS测定A549细胞表达空载体（Vec，填充条）或LKB1（LKB1，开放条）的C-谷氨酰胺(D类)LKB1-缺陷A549细胞的代谢通量分析。表达空载体（Vec）或LKB1 cDNA（LKB1）的A549细胞用13C-葡萄糖或13C-谷氨酰胺1小时，以及13通过GC-MS测定乳酸和TCA循环代谢物中的C掺入量13葡萄糖（黑色）和谷氨酰胺（灰色）的阴影条表示C进入总代谢物池。代谢物丰度相对于A549/LKB1细胞的基础水平表达*P（P）< 0.05.
图3。
图3。
LKB1-null细胞显示出增强的生长和生物合成能力。(A类)LKB1生长曲线飞行/飞行根据3T3传代协议表达空载体（CRE−，开环）或CRE重组酶（CRE+，填充环）的MEF。(B类)通过流式细胞术的细胞前向散射（FSC）测定的对照（Cre−，灰度直方图）或LKB1缺陷（Cre+，开放直方图。(C类和D类)LKB缺失的MEFs的葡萄糖和谷氨酰胺依赖性脂质生物合成。对照组（Cre−，开条）或LKB1-满组（Cre+，闭条）MEF用统一标记培养14C-葡萄糖(C类)或14C-谷氨酰胺(D类)72h后，测定提取脂质的放射性计数。数据表示为每10 cpm6样品的细胞（平均值±SEM）一式三份。(E类)LKB1-null癌细胞中的游离脂肪酸（FFA）水平。生长3d后，用GC-MS测定A549/Vec或A549/LKB1细胞提取物中的FFA。数据表示为A549/Vec中FFA物种与A549/LKB1细胞的比率*P（P）< 0.05.
图4。
图4。
在常氧条件下，LKB1缺失促进HIF-1α蛋白表达。(A类)免疫印迹法检测在20%O下生长的对照（Cre−）或LKB1-null（Cre+）MEF的全细胞裂解物中HIF-1α蛋白的表达2. (B类)的相对表达式hif1a病毒mRNA通过qPCR测定的对照（Cre−，开条）或LKB1-null（Cre+，填充条）MEF。数据是相对于肌动蛋白三份样品的mRNA水平，相对于对照（Cre−）细胞归一化。(C类)20%O培养A549/Vec或A549/LKB1细胞裂解液中HIF-1α蛋白的免疫印迹2. (D类)的相对表达式阿尔多,土地使用权，以及pdk1型通过qPCR测定对照组（Cre-，开条）或LKB1-满组（Cre+，填充条）MEF中的mRNA水平。(E类)免疫印迹法检测细胞裂解物中醛固酶、PDK1和LDHA的表达D类.
图5。
图5。
LKB1依赖性HIF1α表达受mTORC1和ROS调节。(A类)免疫印迹法检测来自对照（Cre−）或LKB1-null（Cre+）MEF的全细胞裂解物中LKB1、pS6、p4EBP和肌动蛋白水平。(B类)细胞溶解前，用免疫印迹法检测含（+）或不含（−）25 nM雷帕霉素培养24 h的A549/Vec或A549/LKB1细胞中HIF-1α蛋白水平。显示了LKB1、pS6和肌动蛋白的水平。(C类)来自用25nM雷帕霉素或载体对照处理24小时的对照（Cre−）或LKB1缺陷（Cre+）MEFs的MEFs细胞中HIF-1αmRNA的相对表达(D类)免疫印迹法检测用对照（Ctl）或Raptor特异性（Rapt）siRNA处理的对照（Cre−）和LKB1-null（Cre+）MEF的全细胞裂解液中Raptor和HIF-1α蛋白水平(E类)LKB1中DFC-DA染色的相对平均荧光强度（MFI）飞行/飞行表达（+）或不表达（−）Cre的细胞。用或不用10mM处理细胞N个-活性氧测量前，乙酰半胱氨酸（NAC）持续1小时。(F类)HIF-1α蛋白在细胞中表达的代表性免疫印迹E类.
图6。
图6。
HIF-1α促进LKB1丢失诱导的代谢程序。(A类)显示了用对照或HIF-1αsiRNA处理的对照（Cre−）或LKB1缺陷（Cre+）MEF裂解物中HIF-1β蛋白表达的免疫印迹。LKB1和肌动蛋白水平。(B类)按以下方式处理的细胞产生的乳酸A类生长72小时后。(C类)对照组的前向散射（FSC）（灰度直方图）、LKB1缺陷（开放直方图。(D类)表达对照（−）或HIF-1α特异性（+）shRNAs的A549/Vec或A549/LKB1细胞裂解物中HIF-1蛋白水平的免疫印迹。显示LKB1和肌动蛋白水平。(E类)通过酶分析测定表达对照（黑条）或HIF-1α特异性（灰条）shRNAs的A549细胞的谷氨酰胺消耗。(F类)表达对照（−）或HIF-1α特异性（+）shRNA的A549细胞中谷氨酰胺衍生的谷氨酸水平。13培养1小时后C并入细胞内谷氨酸13C-谷氨酰胺通过GC-MS测定*P（P）< 0.05.
图7。
图7。
HIF-1α是LKB1-缺陷细胞生长和存活所必需的，以应对营养限制。(A类)表达对照（黑圈）或HIF-1α（灰圈）shRNA的A549细胞在全糖（25 mM）或低糖（0.4 mM）条件下生长的生长曲线。(B类)表达对照（−）或HIF-1α特异性（+）shRNA的A549/LKB1（白条）或A549/Vec（黑条）细胞在无葡萄糖或谷氨酰胺培养基中培养后的存活率。48小时后通过碘化丙啶摄取测定细胞存活率。(C类)在降低葡萄糖浓度培养后，表达对照（Vec，黑圈）或HIF-1α特异性（灰圈）shRNA的A549细胞中的Caspase-3激活。(D类)在无葡萄糖或谷氨酰胺培养基中培养后，表达对照（黑条）或HIF-1α特异性（灰条）shRNA的A549细胞的相对ATP水平**P（P）< 0.01.
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