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.2013年10月9日；33(41):16297-309.
doi:10.1523/JNEUROSCI.4616-11.2013。

利用无细胞蛋白工程自动化开发的光遗传传感器可视化突触抑制

约书亚·S·格里姆利 1, 李丽, 王维娜（Weina Wang）, 雷文, Lorena S Beese公司, 霍姆·W·赫林加, 乔治·奥古斯丁
附属公司

利用无细胞蛋白工程自动化开发的光遗传传感器可视化突触抑制

约书亚·S·格里姆利等。 神经科学. .

摘要

我们描述了一种工程荧光光基因传感器SuperClomeleon，它通过报告外源GABA或抑制性突触活动产生的细胞内氯化物变化，在单个培养的小鼠神经元中强烈检测抑制性突触体活动。使用绕过基因克隆的无细胞蛋白质工程自动化方法，我们反复构建、生产和分析了数百个结合位点残基突变，以确定第一代次优传感器Clomelon的改进。结构分析表明，这些改进涉及卤化物接触和远端侧链重排。对神经活动作出反应的光遗传传感器的发展使细胞能够利用光学信号而不是电生理信号来跟踪神经活动。利用体外蛋白质工程构建这种传感器为开发新的脑成像探针奠定了强有力的途径。

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数字

图1。
图1。
YFP中的碘结合位点。一《YFP的结构》（Wachter等人，2000）−（紫色）相对于发色团（黄色）。B类，碘结合位点，包括选择用于诱变的残留物（下划线）。
图2。
图2。
蛋白质工程方法。
图3。
图3。
YFP变体的氯化物结合特性。一、性能评估、相关CI−亲和力匹配（Δȳ5,6)和ΔF类最大值相对于CT（ΔF类最大值，CT)：他的148个变体，开放圆；His148Q变体，闭合圆；单株突变体，浅灰色；双突变体，中灰色；三个突变体，黑色；CT，深红色；H148Q，红色开圈；Q69T/V163A，浅红色；Q69T，黄色；V150A/V163A，绿色；Q183A，蓝色；Q183G，品红色；H138Q/V163A/L201I，绿色开圈；随后包含在高阶结构X中的单或双突变体。垂直虚线表示K（K）d日5.5米米，在[Cl的中点−]我成熟神经元突触抑制成像的相关范围。B类性能评估，性能指标的相关值，ρ5.5，含Cl−密切关系。突变株的分布减少（ρ5.5<1），改善（1<ρ5.5<2），且优于（ρ5.5<2）显示性能。中的颜色和符号一.C类，氯−滴定产生的选定变体在体外（实心圆圈，实线；无重复）或常规表达（开放圆圈，虚线；四次重复）。误差条表示1 SD。荧光值缩放为Clomeleon。颜色如中所示一.竖线表示[Cl−]我5至6米米，成熟神经元中突触抑制成像的相关性范围。
图4。
图4。
热稳定性及其对氯化物结合的依赖性。一、Q69T/V163A CD（黑色）和荧光（红色）数据在pH 6.0下同时采集，符合二态展开机制。吨米由于pH值、缓冲液、加热速度和设备的差异，67.0±0.1°C（CD）和67.2±0.1°C（荧光）的值与表1中的条目不同。B类、Cl的影响−此外，pH值为7.1，对YFP变体的热稳定性（四次重复；误差条表示1 SD）有影响。为了清晰起见，Q69H和Q69M数据点和错误条被删除。
图5。
图5。
pH值对氯化物亲和力的影响。一pH值对Cl的影响−图示为传统表达的Q69T/V163A的滴定。荧光发射相对于pH 7.1和无Cl条件下测得的荧光量进行标准化−.B类，所选变体的pH依赖性。
图6。
图6。
Q69T/V163A中的碘结合位点。一，碘结合位点I（底部）和II（顶部）的位置。B类，碘化物结合结构的异常差异图（4.0σ），为清晰可见，删除了站点I EG。占用值为0.2（站点I碘化物）、0.4（站点II碘化物）和0.8（站点I EG）。复合省略I的映射−（紫色）络合物(C类)和apo结构(D类)均为1.2σ。场地I周围的残留物(E类)和II(F类)，叠加I−复合物（蓝色）、载脂蛋白（洋红色）和YFP（浅棕色；Wachter等人，2000年）。边界I的着色−与脚手架匹配。站点I的EG（黄色）表示载脂蛋白。G公司，复合物省略了apo结构中甲酸盐（黄色）与生色团和Tyr203的映射（1.5σ）。
图7。
图7。
神经元中SuperClomelon的滴定。一，氯离子成像−-表达SuperClomelon的单个海马神经元中FRET比率（535/485 nm发射）的依赖性变化。用离子阱处理钳制[Cl−]我至指示值。B类，FRET排放比随[Cl变化而变化的时间过程−]我在如所示的单元格中一.C类，氯−所示克洛梅隆变体的滴定曲线（如文中所述，克洛梅龙重复23次，其变体重复4–21次）。曲线显示与方程式的拟合。11，SEM用误差线表示。F类−表示161 m处测得的FRET值米F类−.Inset说明由规范化的数据R（右）最小值和R（右）最大值值，以便比较相对Cl−克洛梅隆变种的亲缘关系。D类，根据中显示的数据估计的s/nC类将克隆转化为超级克隆包括以下附加改进：克隆（黑色）、缩短域间连接子（红色）、两个域中的S30R点突变（蓝色）、中间亲和调谐突变（白色）、YFP中的Q69T/V163A双突变（青色），以及将CFP域替换为Cerulean（洋红）。还显示了Markova等人（2008）描述的H148Q/I152L/V163S变体（白色）进行比较。
图8。
图8。
GABA诱导氯通量的超级克隆监测。一GABA从移液管（GABA）局部应用于单个神经元，这些神经元通过第二个记录移液管进行膜片钳固定（记录）。B类，同时测量GABA活化的Cl−在不同的膜电位（下划线）下，单个神经元的电流（较低）和SuperClomelon FRET比率的变化（535/485 nm发射；较高）。箭头指示GABA应用（100 ms）。注意上记录道和下记录道的不同时间刻度。C类、综合Cl变化的时间进程比较−电流（电荷）和535/485 nm发射比（FRET）响应GABA应用（如箭头所示），在−50 mV的保持电位下测量。已对痕迹进行归一化（并对电荷进行倒置），以便对其动力学进行比较。D类、GABA诱导的综合Cl变化之间的关系−电流（充电）和FRET信号B类.E类，表达SuperClomeleon（红色，10个细胞）或Clomeleo（黑色，7个细胞）的细胞的聚合数据。直线表示线性回归拟合数据，斜率为10.1±0.5（SEM）s·nC−1对于SuperClomelon和2.1±0.2 s·nC−1克洛梅隆。单位年-轴（集成FRET信号）D类和E类是秒。
图9。
图9。
SuperClomelon成像突触抑制。一突触前抑制神经元由细胞外电极（刺激）刺激，而表达SuperClomelon的突触后神经元则通过记录吸管（记录）进行膜片钳固定。B类施加于抑制神经元的一系列简短电刺激（10 Hz，2 s）产生IPSC（低），并改变表达Clomeleon（黑色）或SuperClomeleion（红色）的电压钳位（-50 mV）突触后神经元的FRET比率（535/485 nm发射，高）。注意上记录道和下记录道的不同时间刻度。四次FRET信号试验的平均值是为了从表达Clomeleon的神经元中提取可检测的信号；为了进行比较，对SuperClomelon响应也进行了相同的处理。之所以选择这些例子，是因为它们对刺激具有相似的突触电荷（IPSCs的积分）。C类，由抑制性突触活动引起的FRET比率变化的s/n特征。反应s/n特征通过整合由Clomeleon（黑色）或SuperClomeleion（红色）产生的FRET信号（信号）中刺激诱导的变化，并除以基线FRET噪声来量化。然后，通过将这些反应除以刺激产生的突触电荷，将其归一化，从而解释IPSC中细胞间的差异。个别测量(n个=16（每个指标），然后将其分为若干组，形成累积分布，并用高斯函数（平滑曲线）进行拟合。虚线表示s/n=0；即无信号。D类，IPSP（较低）和FRET比率的变化（535/485nm发射，较高），这些变化是在未处于电压钳下的神经元中响应短暂的电刺激序列（10Hz，2s）而测量的。黑色痕迹来自表达Clomeleon（黑色）的神经元，而红色痕迹则来自表达SuperClomelon的神经元。E类FRET信号综合变化的平均值，或s/n(F类)在表达Clomeleon或SuperClomeleion的神经元中测量IPSP的反应(n个=每个9个单元格）。误差条表示SEM。
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