Inhibitors of glutamate dehydrogenase block sodium-dependent glutamate uptake in rat brain membranes

doi:10.3389/fendo.2013.00123

.2013年9月17日4时23分。

doi:10.3389/fendo.2013.00123。 2013年电子收集。

谷氨酸脱氢酶抑制剂阻断大鼠脑膜对钠依赖性谷氨酸的摄取

布伦丹·S·怀特劳¹, 迈克尔·罗宾逊

附属公司

PMID： 24062726
PMCID公司： PMC3775299
内政部： 10.3389/fendo.2013.00123

谷氨酸脱氢酶抑制剂阻断大鼠脑膜对钠依赖性谷氨酸的摄取

布伦丹·S·怀特劳等。前内分泌（洛桑）. 2013.

.2013年9月17日4时123分。

doi:10.3389/fendo.2013.00123。 2013年电子收集。

作者

布伦丹·S·怀特劳¹, 迈克尔·罗宾逊

附属

¹费城研究所儿童医院，美国宾夕法尼亚州费城。

PMID： 24062726
PMCID公司：下午3775299
内政部： 10.3389/fendo.2013.00123

摘要

最近，我们发现星形胶质细胞Na（+）依赖性谷氨酸转运体（GLT-1/EAAT2和GLAST/EAAT1）与线粒体之间存在解剖和物理联系。在这些相同的研究中，我们发现谷氨酸脱氢酶（GDH）抑制剂表没食子儿茶素单没食子酸酯（EGCG）抑制谷氨酸氧化和Na（＋）-星形胶质细胞对谷氨酸的依赖性摄取。在本研究中，我们通过探索EGCG对大鼠大脑皮层制备的粗膜（P2）中钠（+）依赖的l-[（3）H]-谷氨酸（Glu）摄取的影响来扩展这一发现。在这种制剂中，摄取几乎完全由GLT-1介导。EGCG抑制皮质膜中l-[（3）H]-Glu的摄取，IC50值为230μM。我们还研究了另外两种GDH抑制剂，六氯酚（HCP）和双硫醇（BTH）的作用。这两种化合物还对皮层膜中的谷氨酸摄取产生浓度依赖性抑制。与未经预孵育的对照组相比，用HCP预孵15分钟的效果并不显著，这表明效果发生得很快。HCP在不改变K m的情况下降低了谷氨酸吸收的V max，这与非竞争作用机制一致。EGCG、HCP和BTH还抑制d-[（3）H]-天冬氨酸（Asp）（一种非代谢性转运底物）和[（3”H]-γ-氨基丁酸（GABA）的钠（+）依赖性转运。与前脑相比，粗大小脑膜（P2）中的谷氨酸摄取可能由GLAST（EAAT1）介导。因此，在小脑膜中检测了这些化合物的作用。在该区域，这些化合物均未对l-[（3）H]-Glu或d-[（3。总之，这些研究表明，与小脑相比，GDH是前脑谷氨酸摄取的优先需求，GDH也可能是GABA摄取所需的。它们还为谷氨酸转运和线粒体之间的功能联系提供了进一步证据。

关键词：EAAT2；GABA；玻璃；GLT-1；表没食子儿茶素单没食子酸酯；谷氨酸；谷氨酸脱氢酶；钠依赖性摄取。

PubMed免责声明

数字

图1
**组织匀浆（TH）和各种亚细胞组分中神经元和星形胶质细胞蛋白的分析，如“材料和方法”一节所述**“为了确保信号在线性范围内，每个组分中的3μg蛋白质用于分析GLT-1或GLAST，10μg蛋白质则用于分析其他蛋白质（NMDA受体NR1亚单位、NR1、GFAP和NF-L）。所示的西方斑点均来自一种动物；这些分析在另外三只动物身上进行了复制（数据分析见表1）。

图2
**GDH抑制剂对钠的影响的浓度依赖性⁺-从属的我-[^三H] -谷氨酸转运至皮质制备的粗膜（P2）**.运输我-[^三H] -谷氨酸（0.5μM）是在不存在或存在浓度增加的抑制剂的情况下测量的，如“材料和方法”一节所述。对照百分比表示在存在抑制剂的情况下测量的传输速度除以在不存在抑制剂的情况下观察到的传输速度乘以100。**（A）**EGCG的抑制作用符合带有IC的单位点竞争模型₅₀234μM。**（B）**HCP的抑制作用符合双位点竞争模型。IC₅₀高亲和力组分的值为30 nM，IC₅₀低亲和力组分的值为14μM。基于此拟合，33%的位点具有高亲和力，67%的位点亲和力较低。**（C）**BTH的抑制作用符合带IC的双位点竞争模型₅₀对于84 nM的级分1（42%）和IC₅₀26μM组分2（58%）。数据是至少三次独立测量的平均值±SEM（除了1μM BTH的培养，其中只有两次观察）。

图3
**HCP（6μM）预孵育对Na的影响⁺-从属的我-[^三H] -谷氨酸转运至皮质制备的粗膜（P2）**在运输开始前1、3、5、10或15分钟，在37°C下将HCP（或载体）添加到粗膜（P2）中，并添加我-[^三H] -谷氨酸，或同时与我-[^三H] -谷氨酸（时间=0分钟）。控制百分比表示存在抑制剂时的传输速度除以不存在抑制剂时观察到的传输速度乘以100。数据是至少三个独立测量值的平均值±SEM。

图4
**Eadie–Hofstee的浓度依赖关系图我-[^三H] -未经处理（对照；圆形）、0.1μM HCP（方形）或6.0μM HCP（三角形）的皮质制备的粗膜（P2）中谷氨酸的转运**吸收量的测定如“材料和方法”一节所述。所提供的数据来自一个单独的实验，该实验在四个独立的实验中重复进行，结果相似。这个*K（K）*_米溶媒对照组的转运值为5.7±0.3μM，0.1μM HCP存在时为5.4±0.4μM，6.0μM HCP存在时为4.2±1.0μM。这个*V（V）*_最大值载体对照组的转运值为1.6±0.4（nmol/mg蛋白质/min），0.1μM HCP存在时为1.2±0.4，6.0μM HCP存在时为0.7±0.1。这个*K（K）*_米或*V（V）*_最大值每个实验的值均归一化为车辆对照组（设置为100%），并与在HCP存在下观察到的值进行比较。HCP对*K（K）*_米值，但显著降低了*V（V）*_最大值0.1μM时的值(第页 < 0.01）或6μM(第页 < 0.001).

图5
EGCG（300μM）、HCP（6μM）或BTH（3μM）对Na的影响⁺-从皮质（开栅）或小脑（阴影栅）制备的粗膜（P2）中测得的L-谷氨酸（A）、D-天冬氨酸（B）或GABA（C）的依赖性转运。如“材料和方法”一节所述，使用不同的载体对照物进行平行实验，测量两个大脑区域中所有三种底物的转运。数据是至少三个独立实验的平均值±SEM。通过方差分析将数据与车辆对照组进行比较*表示第页 < 0.05，**表示第页 < 0.01，***表示第页 < 0.001.

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