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.2013年3月27日；33(13):5773-84.
doi:10.1523/JNEUROSCI.4247-12.2013。

中枢神经系统钙蛋白酶的条件性破坏改变树突形态，损害LTP，并促进损伤后神经元的存活

曼达娜·阿米尼 1, 马春蕾, 拉苏尔·法拉齐法尔德, 朱国琦, 张毅（音）, 杰奎琳·范德路易特, 乔安娜·苏西·佐尔特维茨, 法迪·哈格, 约瑟夫·萨维特, 黛安·拉盖斯, 露丝·S·斯拉克, Jean-Claude Beique牛仔裤, 米歇尔·鲍德利, 彼得·格里尔, 理查德·贝杰伦, 大卫·S·帕克
附属公司

中枢神经系统钙蛋白酶的条件性破坏改变树突形态，损害LTP，并促进损伤后神经元的存活

曼达娜·阿米尼等。 神经科学. .

摘要

普遍存在的经典（典型）钙蛋白酶，钙蛋白酶-1和钙蛋白酶-2，是钙（+2）依赖性半胱氨酸蛋白酶，与许多生理和病理细胞功能有关。然而，由于大脑中缺乏适当的缺失范式，对钙蛋白酶在中枢神经系统中的作用的清楚理解受到了阻碍。在本研究中，我们描述了小鼠大脑中钙蛋白酶-1和钙蛋白酶-2活性的条件缺失的独特模型，该模型更明确地评估了这些普遍存在的蛋白酶在大脑发育/功能和病理中的作用。令人惊讶的是，我们发现这些钙蛋白酶对中枢神经系统发育并不重要。然而，calpain-1/calpain-2的缺失导致树突分支复杂度降低和脊椎密度缺陷，与海马长期增强和空间记忆的严重恶化相关。此外，钙蛋白酶-1/钙蛋白酶-2缺陷的神经元对兴奋性毒性应激或线粒体毒性诱导的损伤具有显著抵抗力。下游靶点的检查表明，Cdk5激活物p35转化为致病性p25形式仅发生在钙蛋白酶存在的情况下，并且在钙蛋白酶介导的神经元死亡中起主要作用。这些发现明确确立了钙蛋白酶-1/钙蛋白酶-2在中枢神经系统可塑性和神经元死亡功能中的两个中心作用。

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数字

图1。
图1。
钙蛋白酶-1和钙蛋白酶-2表达和活性的中断CAPNS1-Nestin-cKO公司小鼠大脑。一，大脑DNA样本的Southern blot分析CAPNS1-Nestin-cKO公司(雀巢Cre;盖1flox/flox公司)并控制室友(雀巢Cre;盖1 +/弗洛克斯或盖1 +/弗洛克斯). 探针区分对应于未定位的5.1、4.3和3.2 kbp PstI片段(盖1)或之后的浮动等位基因(盖1Cre后)或之前(盖1弗洛克斯)分别进行Cre介导切除。b条，顶部，从脑中提取的钙蛋白酶-2（CAPN2）（80kDa）和CAPNS1（28kDa）蛋白的代表性免疫印迹CAPNS1-Nestin-cKO公司用钙蛋白酶-2抗体检测同窝鼠。底部，分析钙蛋白酶-1和钙蛋白酶-2活性的大脑总分数酪蛋白酶谱图(n个=每个基因型5个）。c（c），用指示的αII谱和活性钙蛋白酶-1抗体探测大脑总蛋白提取物的代表性免疫印迹(n个=每个基因型3个）。氯化钙2触发spectrin裂解为钙蛋白酶特异性145和150kDa分解产物CAPNS1-Nestin-cKO公司脑提取物，而添加大鼠钙蛋白酶-2酶可将两种基因型脑裂解物中的spectrin裂解为150kDa。
图2。
图2。
组织学评估CAPNS1-Nestin-cKO公司小鼠与对照窝鼠的比较。一,b条，代表性的甲酚紫染色通过大脑不同区域的冠状切片(一)E17.5和(b条)4-6周龄成人CAPNS1-Nestin-cKO公司小鼠和对照组，分别包括不同区域（比例尺，1mm）和海马和皮层神经元（比例栏，20μm）。c（c），4-6周龄时定义区域内CA1神经元的数量(n个=每个基因型3个）。d日，胚胎脑BrdU染色切片的代表性显微照片CAPNS1-Nestin-cKO公司并控制室友。比例尺：左侧，175μm；右侧，20μm。在规定的切片字段中计数BrdU阳性细胞的数量(n个=每个基因型4个）。e（电子），全脑切片中TUNEL阳性细胞的数量(n个=每个基因型3个）。
图3。
图3。
海马CA1神经元树突的形态学改变CAPNS1-Nestin-cKO公司老鼠。一，CA1神经元顶端和基底树突的代表性片段CAPNS1-Nestin-cKO公司并控制室友。比例尺：5μm。底部，CA1锥体神经元的代表性显微照片。比例尺：50μm。b条，每个分支级的基底和顶端树突的棘密度的代表图。脊椎密度表示为每1μm树枝状节段的平均脊椎数。c（c），每个分支阶的基底和顶端树突的总脊柱数的代表图。d日，Scholl分析CA1神经元基底树突和顶端树突的交叉模式。e（电子）在CA1神经元中，距胞体辐射距离30μm的基底和顶端树突中的棘分布。（f），基底和顶端树突总长度的代表图(n个=27个神经元，用于控制室友和n个=20个神经元CAPNS1-Nestin-cKOs公司). 数据为平均值±SEM*第页<0.05（重复方差分析）**第页<0.01（重复方差分析）***第页<0.001（重复方差分析）。
图4。
图4。
海马CA1神经元海马膜蛋白分布和谷氨酸能突触传递CAPNS1-Nestin-cKO公司和控件。一、对照组和对照组海马膜蛋白组分的代表性免疫印迹CAPNS1-Nestin-cKO公司用指示的抗体进行探测，并用密度计量化灰度值的变化，以平均值±SEM表示**第页<0.01（学生的t吨测试）***第页<0.001（学生的t吨测试）。每个基因型：n个对于GluN1和GluA1，＝4；n个=5，针对GluN2A、GluN2B和PSD95；n个=GluA2/3为3。b条，分别表示V-保持为−65和+40 mV时AMPAR和NMDAR EPSC的记录道(CAPNS1-Nestin-cKO公司1.32 ± 0.04,n个=来自3只小鼠的9个神经元；并控制1.4±0.1，n个=4只小鼠的8个神经元）。在−65 mV时，峰值电流主要由AMPA受体贡献，而在+40 mV时峰值电流同时来自AMPA和NMDA受体。c（c），NMDAR和AMPAR EPSC在CAPNS1-Nestin-cKO公司（NMDAR 87.07±5.46毫秒，n个=4只小鼠的11个神经元；AMPAR为19.05±0.64ms，n个=4只小鼠的9个神经元）和对照组（NMDAR 71.55±6.42 ms，n个=来自4只小鼠的6个神经元和AMPAR 23.36±2.01 ms，n个=来自4只小鼠的9个神经元）。d日、从以下神经元记录的自发AMPAR介导的mEPSCs的代表性痕迹和平均值CAPNS1-Nestin-cKO公司（振幅，10.27±0.59 pA；频率，0.48±0.07 Hz，n个=来自3只小鼠的8个神经元）和对照小鼠（振幅，9.01±0.34 pA；频率，0.46±0.07 Hz，n个=4只小鼠的8个神经元）。e（电子）、来自神经元的EPSCs（AMPA+NMDAR）的典型轨迹和成对脉冲比率的平均值CAPNS1-Nestin-cKO公司小鼠（50 ms，1.78±0.2；100 ms，1.68±0.14；200 ms，1.44±0.12，n个=来自3只小鼠的9个神经元）和对照组（50 ms，1.85±0.13；100 ms，1.73±0.11；200 ms，1.39±0.07，n个=来自3只小鼠的12个神经元）。
图5。
图5。
用场记录和斑贴灯记录评估钙缺乏小鼠的突触传递和可塑性特征。一，输入/输出曲线。根据不同刺激强度测定fEPSP的振幅。突变小鼠的曲线明显向下移动。结果为平均值±SEM；n个=每个基因型5只小鼠的5片或6片切片*第页<0.05（学生的t吨测试）。b条，TBS诱导的LTP。在基线记录10分钟后进行TBS，再监测50分钟fEPSP的斜率。将值归一化为基线值，为平均值±SEM；n个=每个基因型5只小鼠的5片或6片切片***第页<0.001（学生的t吨测试）。c（c），TBS期间的突发响应区域（以100 Hz的频率发送4个脉冲的10次突发，间隔200 ms）。结果为平均值±SEM，两组小鼠之间无统计学差异；n=每个基因型5只小鼠的5片或6片切片。d日，LTP的补丁灯记录。HFS配对范式前10分钟和后50分钟EPSC振幅的代表性轨迹。底部，EPSC相对变化的时间进程（用于控制n个=来自4只小鼠的6个神经元CAPNS1-Nestin-cKO n号=5个神经元形成4只小鼠）。数据为平均值±SEM。第页该值来自突变体的30–40分钟EPSC平均值与对照的数据比较***第页<0.001（学生的t吨测试）。
图6。
图6。
空间学习缺乏CAPNS1-Nestin-cKO公司小鼠，而运动活动和焦虑行为似乎正常。一，百分比CAPNS1-Nestin-cKO公司（男性，n个= 6; 女性，n个=4）和对照窝友（雄性，n个= 5; 女性，n个=7）小鼠成功达到在莫里斯水迷宫中找到平台的标准，如材料和方法所述。b条，在一项新的笼子测试中评估运动活性。c（c），通过旋转试验检查运动协调性。d日,e（电子），使用高架+迷宫进行焦虑观察(d日)和野外测试(e（电子）). 数据为平均值±SEM*第页<0.05（学生的t吨测试和重复方差分析）。对照组：雄性，n个= 10; 女性，n个= 11;CAPNS1-Nestin-cKO公司：男性，n个= 11; 女性，n个= 10.
图7。
图7。
钙蛋白酶介导PD和缺血相关的兴奋性神经元死亡在体外模型。一,b条、MPP+处理(一)皮层神经元和(b条)中脑神经元，分别为20μ米24小时和48小时的最终浓度显示，钙缺乏神经元对毒素诱导的死亡具有抵抗力（存活率分别为96±10%和58±1%，48小时为52±5%和34±2%，24小时为83±1%和61±4%，48小时分别为70±3%和45±1%；n个=每个基因型4个）。c（c），CGNs在50μ米最终浓度为70分钟，然后在10μ米MK801（生存率68±4%vs 47±4%；n个=每个基因型6个）。d日CGN低氧（1%氧气）处理4-5小时，然后在有无10μ米MK801（生存率，72±9%vs 43±9%；n个=每个基因型4个）。数据为平均值±SEM*第页<0.05（学生的t吨测试）**第页<0.01（学生的t吨测试）***第页<0.001（学生的t吨测试）。
图8。
图8。
p35是钙蛋白酶的靶点，p25裂解产物介导兴奋毒性神经元死亡。一,b条，代表性免疫印迹显示p35裂解为p25后增加(一)MPP公司+和(b条)对照组小鼠皮层神经元和CGN中的谷氨酸处理CAPNS1-Nestin-cKO公司(n个=每个基因型5个）。c（c）,d日，敏化的图形表示(c（c）)皮层神经元和(d日)CGN至MPP+和谷氨酸，以及AAV导向p25过度表达对钙蛋白酶缺乏神经元的再敏感性(n个=每个基因型3个）。数据为完整细胞核数量的平均值±SEM。c（c）, *第页<0.05，对照组与表达GFP并用MPP治疗的突变神经元+（学生的t吨测试）。d日, ***第页<0.001，来自表达p25或GFP的突变体的神经元，用谷氨酸处理（Student’st吨测试）。
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