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.2013年4月；23(4):491-507.
doi:10.1038/cr.2013.2。 Epub 2013年1月1日。

XBP-1u通过促进癌细胞中FoxO1的降解来抑制自噬

赵莹（音） 1, 薛莉, 蔡木彦, 柯玛, 泾阳, 周静怡, 万福, 傅振伟, 王丽娜（Lina Wang）, 谢丹（Dan Xie）, 魏国柱
附属公司

XBP-1u通过促进癌细胞中FoxO1的降解抑制自噬

赵莹（音）等。 单元格Res. 2013年4月.

摘要

自噬被激活以维持细胞能量稳态，以应对营养素饥饿。然而，自噬并不是持续激活的，这在机械水平上还很难理解。在这里，我们报道FoxO1的周转与谷氨酰胺饥饿引起的动态自噬过程有关。X-盒结合蛋白-1u（XBP-1u）通过将FoxO1补充到20S蛋白酶体中，在FoxOl降解中起着关键作用。此外，发现Ser61和Ser176上细胞外调节蛋白激酶1/2（ERK1/2）对XBP-1u的磷酸化对于谷氨酰胺饥饿时XBP-1u和FoxO1之间的相互作用增加至关重要。此外，XBP-1u的敲低导致FoxO1的持续水平和自噬的持续激活，导致细胞活力显著降低。最后，XBP-1u和FoxO1表达之间的负相关与在许多人类癌症组织中观察到的表达情况非常一致。因此，我们的发现将自噬的动态过程与XBP-1u诱导的FoxO1降解联系起来。

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数字

图1
图1
动态诱导自噬与FoxO1水平的变化有关。（A）Western blotting用于确定HCT116细胞中FoxO1总表达水平、p62降解和LC3-II积累，以应对72小时以上的谷氨酰胺饥饿（上部面板）。还提取蛋白质，与抗FoxO1抗体共同免疫沉淀，并用抗Atg7或抗乙酰化赖氨酸进行探测（下部面板）。（B）电子显微照片显示HCT116细胞中饥饿长达48小时的自噬囊泡。（C）谷氨酰胺饥饿72小时后，在HCT116细胞中观察到LC3-免疫阳性点状信号。（D）LC3阳性点状细胞的定量分析C类（上部面板）。计数的标准是具有10个以上穿孔的单元。乙酰化FoxO1的变化分析A类（下部面板）。对每条带进行扫描，并确定相对密集的平均密度。数据表示为平均值±SD(n个= 3).（E）HCT116细胞被标记为[三H] -亮氨酸48小时，清洗，孵育24小时，然后在有或无3-MA的情况下，谷氨酰胺饥饿72小时。通过计算放射性来测量长寿命蛋白质的相对降解。数据为平均值±SD(n个= 3).（F）,G）还进行了蛋白质印迹以确定A549中FoxO1总表达、FoxO1乙酰化、p62降解和LC3-II积累的水平（F），或HeLa细胞（G）对谷氨酰胺饥饿超过48小时的反应。
图2
图2
FoxO1通过20S蛋白酶体途径降解。（A）定量PCR（qPCR）用于测量HCT116细胞对谷氨酰胺饥饿72小时后FoxO1 mRNA的表达水平。（B）,C）采用Western blotting法测定HCT116细胞中FoxO1水平，以应对谷氨酰胺饥饿48小时以上（含或不含MG132（2μM））（B）、CHQ（10μM）或钙肽（50μM）（C）.（D）用编码FoxO1（WT）或FoxO1（3A）的质粒转染H1299细胞。转染后24小时，H1299细胞在MG132存在或不存在的情况下谷氨酰胺饥饿24小时，然后提取蛋白质，并进行western blotting检测FoxO1水平的变化。（E）HCT116细胞在无谷氨酰胺培养基中在有无MG132的条件下培养48小时。提取细胞核和细胞质蛋白，并通过western blotting分析FoxO1水平。HDAC1被用作核蛋白的负荷控制，而微管蛋白被用作细胞质蛋白质的负荷控制。（F）用编码flag-FoxO1和HA-ubiquitin的质粒共同转染H1299细胞，然后在无谷氨酰胺培养基中在MG132（2μM）存在下孵育24小时。细胞裂解物用抗旗帜抗体进行免疫沉淀，并用抗泛素抗体进行印迹。底部面板显示等量的FoxO1。p53泛滥成灾被用作阳性对照。（G）用flag-FoxO1转染H1299细胞。转染24小时后，H1299细胞被谷氨酰胺饥饿达48小时，细胞裂解物用抗凝抗体免疫沉淀，并用抗20S蛋白酶体抗体印迹。（H） 体外-翻译后的FoxO1蛋白与20S蛋白酶体在MG132（10μM）存在或不存在的情况下孵育90分钟。孵育后，通过western blotting分析检测样品。
图3
图3
XBP-1u参与诱导FoxO1降解。（A）分别将标记的XBP-1u、XBP-1s或空质粒转染HCT116细胞，并通过western blotting检测内源性FoxO1蛋白水平。（B）用XBP-1u特异性或非特异性siRNA转染HCT116细胞。转染48小时后，HCT116细胞核内谷氨酰胺饥饿达48小时，提取细胞裂解物以定量测定XBP-1u或FoxO1水平。（C）使用特异性表达突变XBP-1u的质粒进行拯救实验，以验证在存在或不存在谷氨酰胺饥饿的情况下，XBP-1u在HCT116细胞中诱导FoxO1降解的活性。（D）HCT116细胞在MG132的存在下谷氨酰胺饥饿达48小时，提取细胞裂解物与抗XBP-1u抗体共同免疫沉淀，然后用抗FoxO1抗体进行探测。（E）在细菌中表达并纯化全长XBP-1u以及XBP-1u的N端和C端片段；然后将这些蛋白质与在体外-翻译为FoxO1。Western blotting检测XBP-1u与FoxO1的相互作用。（F）将编码GFP-FoxO1和标记-XBP-1u的质粒联合转染H1299细胞，并用抗标记抗体染色后进行免疫荧光。（G） 体外-翻译后的FoxO1蛋白与添加GST（阴性对照）或各种GST-XBP-1u融合蛋白的20S蛋白酶体孵育；培养1h后，用westernblotting分析检测样品。（H）GST或GST-FoxO1融合蛋白与20S蛋白酶体在有或无在体外-翻译的野生型或突变型XBP-1u。western blotting分析20S蛋白酶体和GST-FoxO1融合蛋白。
图4
图4
ERK信号通路的激活与FoxO1降解有关。（A）采用Western blotting检测在PD098059（10μM）或SB203580（10μM）存在下HCT116细胞中FoxO1水平，以响应谷氨酰胺饥饿48小时。（B）用ERK1/2特异性或非特异性siRNA转染HCT116细胞。转染后48 h，HCT116细胞核内谷氨酰胺饥饿24 h，无论是否有MG132（2μM），然后用抗ERK1/2或抗FoxO1抗体提取细胞裂解液进行western blotting。（C）用标记的FoxO1（WT）转染H1299细胞)或FoxO1（9A）。转染后24 h，细胞接受谷氨酰胺饥饿24 h。提取细胞裂解物，并用抗旗帜或抗β-肌动蛋白抗体进行免疫印迹。（D）HCT116细胞在无谷氨酰胺培养基中培养72小时，提取细胞裂解物与抗XBP-1u抗体进行联合免疫沉淀，并用抗磷丝氨酸抗体进行探测。使用其中XBP-1u和XBP-1s均过表达的细胞提取作为阳性对照。（E）用编码XBP-1u（WT）或XBP-1u（S61/176A）的质粒转染HCT116细胞。转染24小时后，提取细胞裂解物与抗XBP-1u抗体进行联合免疫沉淀，并用抗磷丝氨酸抗体进行检测。（F）GST-XBP-1u与ERK1在30°C下孵育60分钟，通过添加样品加载缓冲液终止反应。然后对混合物进行Mn测试2+-Phos-tag SDS-PAGE，并用抗XBP-1抗体进行western blotting分析。
图5
图5
ERK对XBP-1u的磷酸化对XBP-1 u和FoxO1的相互作用增加至关重要。（A）HCT116细胞在无谷氨酰胺培养基中在PD098059（10μM）存在或不存在的情况下孵育24小时。提取细胞裂解物，与抗XBP-1u抗体共同免疫沉淀，并用抗FoxO1抗体进行探测。（B）对从上述处理中提取的细胞组分进行分析，以确定XBP-1u的细胞定位。HDAC1被用作核蛋白的负荷控制，而微管蛋白被用作细胞质蛋白质的负荷控制。（C）XBP-1u的定位是通过将编码鞭毛的质粒转染HCT116细胞来确定的，HCT116是在无谷氨酰胺培养基中培养的，有无PD098059。治疗24小时后，使用抗标记抗体进行免疫染色。为了进行量化，每个盖玻片计数100个细胞，结果显示为细胞百分比。中显示的值C类是平均值±SD(n个= 3).（D）提取细胞核和细胞质蛋白，并进行western blotting分析野生型和突变型XBP-1u的细胞定位。（E）通过将XBP-1u转染到HCT116细胞并用抗标记抗体进行免疫染色来确定野生型或突变型XBP-1u的定位（左面板）。为了进行量化，每个盖玻片计数100个细胞，结果显示为细胞百分比。中显示的值E类是平均值±SD(n个=3）（右侧面板）。（F）将编码鞭毛-XBP-1u（WT）或鞭毛-XXP-1u（S61/176A）的质粒转染HCT116细胞24h后，提取细胞裂解液与抗鞭毛抗体进行联合免疫沉淀，并用抗20S蛋白酶体抗体进行探针检测。（G）在MG132（2μM）存在或不存在的情况下，用一个或多个编码标记-XBP-1u（WT）、标记-XXP-1u（S61/176A）或标记-XXB-1u（1-204）的对照质粒转染HCT116细胞。治疗24小时后，提取细胞裂解物，并用抗旗帜、抗FoxO1或抗β-肌动蛋白抗体进行免疫印迹。
图6
图6
下调XBP-1u可诱导自噬。（A）HCT116细胞转染一个对照质粒或编码鞭毛-XBP-1u或鞭毛-XXP-1s的质粒。转染后24 h，在E64/胃蛋白酶抑制素A存在或不存在的情况下，将细胞进行谷氨酰胺饥饿12 h。提取细胞裂解物，并用抗旗帜抗体、抗FoxO1抗体、抗LC3抗体、抗p62抗体或抗β-肌动蛋白抗体进行免疫印迹。（B）HCT116细胞转染一个对照质粒或编码鞭毛-XBP-1u或鞭毛-XXP-1s的质粒。转染后24h，细胞遭受谷氨酰胺饥饿24h，观察LC3点状信号的形成（左面板）。计数的标准是具有10个以上穿孔的单元。右侧面板显示了LC3点状细胞与HCT116细胞总数之比的量化。值如所示B类是平均值±SD(n个= 3).（C）将稳定的XBP-1-RNAi HCT116细胞在无谷氨酰胺培养基中孵育长达72小时。提取细胞裂解物并用抗FoxO1、抗LC3、抗p62或抗β-肌动蛋白抗体进行免疫印迹。（D）将稳定的XBP-1-RNAi HCT116细胞在无谷氨酰胺培养基中培养72小时，观察到LC3点状信号的形成（上面板）。下面板显示了LC3点状细胞与HCT116细胞总数之比的量化。计数的标准是具有10个以上穿孔的单元。中的值D类是平均值±SD(n个=3）（下面板）。（E）电子显微照片显示在不含谷氨酰胺的培养基中孵育48小时的稳定XBP-1-RNAi HCT116细胞系中的自噬小泡。（F）用XBP-1-RNAi标记稳定的HCT116细胞系[三H] -亮氨酸48小时，清洗，孵育24小时，然后在有或无3-MA的情况下，谷氨酰胺饥饿72小时。通过计算放射性来测量长寿命蛋白质的相对降解。数据为平均值±SD(n个= 3).（G）将稳定表达XBP-1-RNAi或XBP-1/FoxO1双RNAi的HCT116细胞和HCT116癌细胞株在无谷氨酰胺培养基中孵育48 h，在有或无E64/胃蛋白酶抑制素A的情况下。提取细胞裂解物并用抗XBP-1u、抗FoxO1、抗LC3、抗p62或抗β-肌动蛋白抗体进行免疫印迹。
图7
图7
XBP-1u和FoxO1的表达水平与细胞活性相关，并且在人类癌症样本中呈负相关。（A）HCT116细胞和稳定表达XBP-1 RNAi或XBP-1/FoxO1双RNAi的HCT116肿瘤细胞株谷氨酰胺缺乏，治疗72小时后用PI染色。用流式细胞术计数PI染色（死亡）细胞，并表示细胞死亡百分比。数值为平均值±SD(n个= 3).（B）稳定的XBP-1 RNAi HCT116细胞系在有或无3-MA（10 mM）或有或无Z-VAD-fmk（50μM）的情况下，谷氨酰胺饥饿72小时。PI染色后计数细胞数。数值为平均值±SD(n个= 3).（C）,D）CRC组织中XBP-1、FoxO1和p62的免疫组织化学染色。CRC样本（病例26）显示肿瘤细胞中XBP-1和p62高表达，FoxO1低表达（C）另一个CRC样本（病例139）显示肿瘤细胞中FoxO1高表达，XBP-1和p62低表达（D）.（E）显示自噬与XBP-1u诱导的FoxO1降解（响应谷氨酰胺饥饿）之间关系的示意模型。
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中的注释

  • 非分裂XBP1通过FoxO1控制自噬。
    维达尔RL，赫茨C。 Vidal RL等人。 Cell Res.2013年4月；23(4):463-4. doi:10.1038/cr.2013.9。Epub 2013年1月22日。 2013年细胞研究。 PMID：23337584 免费PMC文章。

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