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.2012年12月；3(12):1615-28.
doi:10.18632/目标762。

变构mTOR抑制剂替米罗莫司与氯法拉宾联合治疗急性髓细胞白血病

弗朗西丝卡·齐亚里尼 1, 安娜丽莎·洛内蒂, 加布里埃拉·特蒂, 埃斯特·奥西尼, 丹妮拉·布列萨宁, 亚历山德拉·卡佩里尼, 弗朗西丝卡·里奇, 路易吉·塔扎里码头, 安德烈亚·奥格尼宾, 米雷拉·法尔科尼, 帕格里亚罗（Pasqualepaolo Pagliaro）, 伊利亚·亚科布奇, 马蒂内利, 塞尔吉奥·阿马多里, 詹姆斯·麦考布雷, 阿尔贝托·马泰利
附属公司

变构mTOR抑制剂替米罗莫司与氯法拉宾联合治疗急性髓细胞白血病

弗朗西丝卡·齐亚里尼等。 肿瘤靶点. 2012年12月.

摘要

在急性髓性白血病（AML）患者中，通过磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）途径及其下游效应物Akt和雷帕霉素（mTOR）的机制靶点的信号异常激活，从而促进白血病细胞增殖、存活和耐药性。因此，抑制AML母细胞中的mTOR信号可以提高其对细胞毒药物的敏感性。临床前数据还表明，雷帕霉素对变构mTOR的抑制会损害白血病起始细胞（LICs）的功能。在本研究中，我们评估了替米罗莫司（一种变构mTOR复合物1（mTORC1）抑制剂）与氯法拉宾（一种核苷类似物，对核糖核苷酸还原酶和DNA聚合酶都有较强的抑制作用）的联合治疗潜力。该药物组合（CLO-TOR）对一组AML细胞系和AML患者的原代细胞表现出协同细胞毒作用。CLO-TOR治疗可诱导G/G期细胞周期阻滞、凋亡和自噬。CLO-TOR在AML患者冲击波亚群（CD34~+/CD38⁻/CD123~+）中具有促凋亡作用，该亚群富含假定的白血病起始细胞（LIC）。总之，CLO-TOR联合治疗可能是AML患者的一种新的有价值的治疗方法，同时也考虑到其对LIC的疗效。

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利益冲突声明

作者没有利益冲突需要披露。

数字

图1
图1。CLO-TOR影响具有组成性活性PI3K/Akt/mTOR信号通路的AML患者的AML细胞系和母细胞的生存能力
A： 药物治疗24小时后进行MTT分析。结果是至少三个不同实验的平均值±s.d.使用适当的剂量效应分析软件（CalcuSyn）计算每个数据点的组合指数（CI）值。B： 评估细胞增殖，3×105细胞接种在25厘米内2培养瓶和生长曲线由播种后24h采集的细胞直接计数确定。用0.2%台盼蓝在血细胞仪中计数活细胞。C： AML患者的原代细胞，CD33门控+/CD45型低的表达（红色矩形），固定，渗透，AlexaFluor染色®488结合Ser 473 p-Akt或Ser 235/236 p-S6RP的抗体，然后通过流式细胞术进行分析。图中显示了两名具有代表性的患者。D组：用氯法拉宾、替米罗莫司或CLO-TOR处理AML原代细胞96小时后的MTT分析。结果是至少三个不同实验的平均值±SD。每个数据点的组合指数（CI）值的计算如上所述。在A、B和D，CTRL，未处理细胞；氯法拉宾；托尔，替米罗莫司。
图2
图2。CLO-TOR诱导G细胞凋亡和细胞周期阻滞0/G公司1细胞周期阶段
A： 流式细胞术分析Annexin V-FITC/PI染色的AML细胞系，用100 nM氯法拉宾（CLO）、100 nM替米罗莫司（TOR）或CLO-TOR组合（100 nM+100 nM）处理8 h。早期凋亡细胞百分比（Annexin-V FITC+/PI公司−右下象限）和晚期凋亡/坏死细胞（Annexin-V FITC+/PI公司+右上象限）。直方图代表了三个单独的实验。CTRL：未处理细胞。B： Western blot分析记录了CLO-TOR（100 nM+100 nM）对caspase-8、caspase-9和-3的激活。用CLO-TOR处理细胞指定时间，收集细胞，然后进行裂解。在SDS-PAGE凝胶上电泳50微克每种裂解物，然后转移到硝化纤维素膜上。GAPDH抗体显示车道负荷相等。分子量显示在右边。C： 用氯法拉宾（CLO，100 nM）、替米罗莫司（TOR，100 nM）或CLO-TOR联合用药（100 nM+100 nM。显示了三个独立实验中的一个代表。D： Western blot分析证明p27的浓度依赖性表达增加基普1用药物处理U937细胞24小时后，β-肌动蛋白抗体显示出相同的车道负荷。分子量显示在右边。CTRL，未处理细胞；CLO，氯法拉滨；托尔，替米罗莫司。
图3
图3。CLO-TOR诱导MOLM-13细胞自噬
A： 用CLO-TOR（100 nM+100 nM）处理细胞达到指定时间，然后进行TEM分析，记录自噬和凋亡诱导。可见含有各种降解细胞器的大细胞质空泡，以及浓缩的凋亡染色质（箭头所示）。显示了显微照片的原始放大倍数。B： Western blot分析用CLO-TOR（100 nM+100 nM）处理指定时间的MOLM-13细胞中Beclin-1和LC3B I/II的表达。β-肌动蛋白抗体显示车道负荷相等。分子量显示在右边。在A和B中，CTRL表示未处理的细胞。
图4
图4。CLO-TOR影响PI3K/Akt/mTOR信号通路关键成分的磷酸化状态以及AML细胞系中p-ERK 1/2水平
A： 用指定浓度的氯法拉宾（CLO）、替米罗莫司（TOR）或药物组合（CLO-TOR）处理细胞24小时，收集并溶解。然后进行蛋白质印迹分析。B： Western blot分析记录了在指定时间内使用单一药物（100 nM）或CLO-TOR（100 nM+100 nM）处理的MOLM-13细胞中p-ERK 1/2水平的变化。在A和B中，在SDS-PAGE凝胶上电泳50μg每种裂解物，然后将其印在硝化纤维素膜上。β-肌动蛋白抗体显示车道负荷相等。分子量显示在右边。在A和B中，CTRL表示未处理的细胞。
图5
图5。CLO-TOR调节AML细胞株中STAT3和c-Myc的表达
A： 用氯法拉宾（CLO，100 nM）、替西罗莫司（TOR，100 nM）或CLO-TOR（100 nM+100 nM）处理48小时的MOLM-13细胞中STAT-3和Ser 727 p-STAT3的蛋白质印迹分析。B：蛋白质印迹分析记录了用CLO-TOR（100 nM+100 nM）处理的MOLM-13细胞中STAT3表达水平的时间依赖性降低。在A和B中，β-肌动蛋白抗体显示出相同的车道负荷。分子量显示在右边。B： 用CLO-TOR（100 nM+100 nM）处理24 h的AML细胞株中STAT3 mRNA表达的qRT-PCR。结果是三个不同实验的平均值±s.d.C:用CLO-TO处理24 h AML细胞系中C-Myc mRNA表达qRT-PCR。结果是3个不同实验±s.d.的平均值。在A-C中，CTRL，未经处理的细胞。D： Western bot分析用不同浓度的CLO-TOR处理48小时的AML细胞株中c-Myc蛋白的表达。β-actin抗体记录了相等的车道负荷。分子量如右图所示。
图6
图6。CLO-TOR影响AML患者样本中mTORC1信号和eIF4F复合物的形成
A： AML患者样本在氯法拉宾（CLO，100 nM）、替米罗莫司（TOR，100 nM）或CLO-TOR（100 nM+100 nM，100h）存在下培养24 h。细胞裂解物通过离心澄清，通过SDS-PAGE分离，并印迹到硝酸纤维素膜上，所述硝酸纤维素膜与Thr 389 p-p70S6K、p70S6K、Thr 37/46 p-4E-BP1、4E-BP1、Thr 202/Tyr 204 p-ERK 1/2和ERK 1/2的抗体一起孵育。β-肌动蛋白抗体证明车道荷载相等。分子量显示在右边。显示了三个具有代表性的样品。CTRL，未经处理的细胞。B： 用CLO-TOR（100 nM）处理的AML患者原代细胞在溶解缓冲液中溶解。通过离心澄清裂解液，并在结合缓冲液中与7-甲基-GTP-Sepharose珠培养。然后在结合缓冲液中清洗珠子三次，并在Laemmli的样品缓冲液中煮沸。然后通过蛋白质印迹分析蛋白质水平。图中显示了两名具有代表性的患者。CTRL，未处理细胞。
图7
图7。CLO-TOR诱导CD34细胞凋亡并调节PI3K/Akt/mTOR信号+/CD38型−/CD123编号+AML患者亚群
A： AML患者的原代细胞检测CD34/CD38/CD123的表达，然后检测CD34的表达+/CD38型−/CD123编号+在用氯法拉宾（100 nM，CLO）、替米罗莫司（100 nM，TOR）或CLO-TOR联合用药（100 nM+100 nM）治疗24小时后，通过流式细胞仪分析细胞亚群是否对Annexin V呈阳性反应。图中显示了一名具有代表性的患者。CTRL，未经处理的细胞。B： 在CD34上进行电子门控后，用CLO-TOR（100 nM+100 nM）培养原代AML细胞24小时+/CD38型−细胞子集，CD123+流式细胞术分析阳性细胞Ser 473 p-Akt表达水平。C： 与B组一样，除了对假定的AML LICs细胞进行Ser 235/236 p-S6RP分析外。在B和C中，显示了一个具有代表性的患者。CTRL，未处理细胞。
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