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.2012;7（8）：e43822。
doi:10.1371/journal.pone.0043822。 Epub 2012年8月24日。

玉米Taxilin蛋白通过改变其亚细胞分布来负调控opaque-2的转录活性

张楠（Nan Zhang） 1, 真一巧, 郑亮, 冰美, 徐正凯, 宋仁涛
附属公司

玉米Taxilin蛋白通过改变其亚细胞分布负调控opaque-2转录活性

张楠（Nan Zhang）等。 公共科学图书馆一号. 2012.

摘要

玉米Opaque-2（ZmO2）蛋白是一种重要的bZIP转录因子，在玉米种子发育过程中调节主要贮藏蛋白（22-kD玉米醇溶蛋白）和其他重要基因的表达。ZmO2通过蛋白质相互作用进行功能调节。为了揭示与ZmO2相关的潜在调控网络，在带有玉米种子cDNA文库的酵母双杂交筛选中，使用截短型ZmO2（O2-2）作为诱饵，进行了蛋白质相互作用研究。在酵母中发现一种与紫杉醇同源的蛋白质与ZmO2有稳定的相互作用，命名为ZmTaxilin。序列分析表明，ZmTaxilin具有一个包含三个保守拉链基序的长螺旋结构域。三个拉链图案中的每一个都能与酵母中的ZmO2相互作用。GST下拉试验证明了GST融合的ZmTaxilin与从发育中的玉米种子中提取的ZmO2之间的相互作用。利用洋葱表皮细胞作为体内检测系统，我们发现ZmTaxilin可以改变ZmO2的亚细胞分布。我们还证明，这种变化显著抑制了ZmO2在22kD玉米醇溶蛋白启动子上的转录活性。我们的研究表明，Taxilin介导的ZmO2亚细胞分布变化可能对ZmO2活性产生重要的功能影响。

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数字

图1
图1。诱饵构建和阳性克隆验证。
(一)ZmO2的结构和三种截短型ZmO2（O2-1、O2-2和O2-3）。AD：酸性活化域；bZIP：碱性亮氨酸拉链结构域；NLS：核定位信号。(B类)O2-2和3-42以及O2-2与1-14之间相互作用的酵母双杂交分析。克隆3-42和1-14是五个阳性Taxilin克隆中的两个（表1）。AD是GAL4激活域，BD是GAL4DNA结合域。3–42+O2-2（或1–14+O3-2）表示猎物蛋白3–42（或1-14）与诱饵蛋白O2-2在酵母细胞中共同表达。AD+O2-2仅代表不含猎物蛋白的AD结构域，与诱饵蛋白O2-2共表达。3–42+BD（或1–14+BD）表示猎物蛋白3–42（或1-14）与BD结构域共表达，不含诱饵蛋白。酵母细胞在DDO选择性培养基（SD/−Leu/−Trp）和QDO（SD/–Ade/−His/−Leu/−Trp）上培养，稀释系列由OD指示600图上方显示的值。
图2
图2。酵母双杂交分析ZmO2、全长ZmTaxilin和ZmTaxelin片段之间的相互作用。
(一)ZmTaxilin、Fra 1、Fra 2、Fra 3、1-14和3-42的示意图。Fra 1、2和3是分别包含拉链1、2和3的三个片段。1–14和3–42是两个阳性克隆，它们相应的蛋白质与酵母中的O2-2相互作用（图1B）。(B类)在酵母细胞中，全长ZmO2与全长ZmTaxilin相互作用。P53+T是阳性对照，其中P53（小鼠P53）与BD融合，SV40（大T抗原）与AD融合。O2+AD和Taxilin+BD是BD-O2融合蛋白与AD共表达或AD-Taxilin融合蛋白与BD共表达的阴性对照。酵母细胞在DDO和QDO+20 mM 3-AT的选择性培养基上稀释培养。(C类)在酵母细胞中，全长ZmO2与Fra 1、2和3相互作用。猎物蛋白Fra 1、2和3与AD融合，并与O2和BD融合蛋白共同转化。AD+ZmO2、AD+BD、Fra1+BD，Fra2+BD和Fra3+BD为阴性对照。
图3
图3。ZmTaxilin和ZmO2在GST下拉分析中相互作用。
(一)用GST抗体对GST下拉样品进行Western blot检测。授粉后3至36天内，内核样本是来自不同发育阶段的等量RNA池。(B类)用ZmO2抗体对GST下拉样品进行Western blot检测。车道1英寸(一)和(B类):大肠杆菌含有GST Taxilin蛋白的裂解物和含有ZmO2的玉米种子蛋白。车道2英寸(一)和(B类):大肠杆菌含有GST的裂解物和含有ZmO2的玉米种子蛋白。GST-Taxilin融合蛋白、GST标签和ZmO2的预期分子量分别为75.397、27.895和47.075 kDa。ZmO2蛋白的表观分子量约为68–72 kDa。
图4
图4。时间和空间表达Zm的士林.
(A、 B类)的表达式Zm的士林在不同的组织中。(C类)的表达式Zm的士林在玉米种子发育过程中。对于时间和空间表达模式Zm的士林在18DAP时，在果仁和果皮中的含量设置为1。
图5
图5。洋葱表皮细胞中ZmTaxilin和ZmO2的共定域。
(一)YFP-O2在洋葱表皮细胞中瞬时表达。(B类)CFP-紫杉醇在洋葱表皮细胞中瞬时表达。(C类)YFP-O2和CFP-Taxilin在洋葱细胞中共表达。差分干涉对比模式用于明场显微镜。白色条代表100µm，蓝色条代表20µm。白色箭头表示细胞核的位置。
图6
图6。ZmTaxilin可抑制ZmO2的转录活性。
(一)效应器和报告器的结构。(B类)不同报告者和效应器组合的GUS/荧光素酶值。这些值是内部控制标准化后三个独立实验的SD平均值。使用双尾T检验计算YFP-O2和YFP-O2+CFP-Taxilin之间的统计显著性*p≤0.05。
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