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.2012年7月15日；26(14):1527-32.
doi:10.1101/gad.190157.112。

通过轴突mTOR信号和4E-BP翻译阻遏物控制神经元中的病毒潜伏期

小林真里子 1, 安格斯·C·威尔逊, 摩西五世·赵, 伊恩·莫尔
附属公司

通过轴突mTOR信号和4E-BP翻译阻遏物控制神经元中的病毒潜伏期

小林真里子等。 基因开发. .

摘要

外周神经神经节中的潜在单纯疱疹病毒-1（HSV1）基因组周期性重新激活，启动生产性复制所需的基因表达程序。轴突检测到的分子线索是否可以传递到细胞体并用于调节神经元细胞核中潜在的基因组表达尚不清楚。使用神经元培养模型，我们发现抑制mTOR、耗尽其调节亚单位猛禽或诱导缺氧都会触发再激活。虽然持续的mTORC1激活抑制了再激活，但突变的4E-BP（eIF4E-结合蛋白）翻译阻遏物对mTORC1-刺激的再激活无反应。最后，抑制轴突中的mTOR可诱导再激活。因此，控制翻译的轴突mTOR信号的局部变化在空间分隔的隔室中调节潜在的HSV1基因组。

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数字

图1。
图1。
干扰神经元中的mTOR信号可诱导潜在HSV1的重新激活。(A类)神经营养因子和RTK介导的PI3-K/Akt信号传导激活mTORC1控制翻译阻遏物4E-BP。雷帕霉素、PP242和猛禽shRNA独立地抑制mTORC1，通过过度磷酸化阻止翻译抑制因子4E-BP1的失活，并抑制cap依赖性mRNA的翻译。(B类)用雷帕霉素（rapa；100 nM）或PP242（2.5μM）处理20 h后，用SDS-PAGE在17.5%凝胶中分离出潜伏感染神经元的总蛋白，并用免疫印迹法进行分析。慢速超磷酸化(顶部箭头）和快速迁移的次磷酸化(底部箭头）4E-BP1表格显示在左边.Tubulin免疫印迹提供负载控制。(C类)mTOR药物抑制剂诱导HSV1活化。用PP242或rapa处理潜伏感染的神经元20 h，用定量RT-PCR（qRT-PCR）测定病毒ICP27 mRNA水平。(D类)如中所示C类除20h外，将培养基取出，立即用缺乏抑制剂的新鲜培养基替换。在5天内对晚期病毒裂解性Us11-EGFP融合蛋白表达产生的EGFP阳性孔进行定量。通常，通过EGFP表达评估，10%-20%的受感染培养物自发重新激活。每个数据点代表96 well板块的20个单井。误差条表示平均值的标准误差（SEM）。(E类)5天后通过菌斑试验评估感染性病毒的产生。条形图显示了20个孔的平均菌斑形成单位（PFU）数量。(F类)如前所述，在阿昔洛韦（ACV）存在的情况下，建立了潜伏感染表达EGFP的HSV1并转导表达shRNA的慢病毒的培养物，该慢病毒针对mTORC1特异性亚单位猛禽或NS对照（Camarena等，2010年；Kobayashi等，2012年）。6天后，取出ACV，20小时后，分离总RNA。用qRT-PCR定量编码裂解HSV调节因子ICP27的mRNA丰度，并将其归一化为NS对照shRNA转导培养物中检测到的水平。误差条表示SEM(插入)5天后通过免疫印迹分析用所指示的表达shRNA的慢病毒转导的神经元的总蛋白。
图2。
图2。
rheb介导的mTORC1持续激活足以维持潜伏期并防止诱导性再激活。(A类)NGF介导的TrkA/PI3-K/AKT通路激活诱导的mTORC1信号转导图。NGF的受体RTK是TrkA。结节性硬化综合征；（Rheb）以GDP和GTP约束形式描述的Rheb。化学抑制剂或突变蛋白（rhebQ64L）在正确的（灰色）。(B–E类)用一种慢病毒转导潜伏感染的神经元，慢病毒编码由dox诱导的启动子表达的HA标记的rheb（Q64L）。20小时后，取出ACV，用含有3μM dox的培养基替换。48小时后，用抑制剂（10μM LY294002、5μM AKT VIII或100 nM雷帕霉素）处理培养物。(B类)添加抑制剂24小时后分离总蛋白，用SDS-PAGE进行分离，并用免疫印迹法进行分析。总AKT和微管蛋白免疫印迹是负荷控制。pAKT是一种磷酸特异性Akt S473抗体。请注意，每个药物治疗小组代表一个独立的免疫印迹实验。因此，无法比较LY294002-、AKT VIII-和雷帕霉素处理的培养物之间HA-Rheb表达的相对水平。(C–E类)在添加抑制剂后20 h收集总RNA，并通过qRT-PCR测定编码HSV必需裂解激活物ICP27的mRNA丰度。误差条表示SEM。
图3。
图3。
低氧应激和cap依赖性mRNA翻译的抑制可触发诱导性再激活。(A类,B类)通过缺氧抑制潜伏感染神经元的蛋白质合成。在1%O中69小时后2，培养物代谢标记为35S氨基酸在1%O中放置3小时2.对照培养物持续保持在正常氧（～20%O）下2)平行标记。缺氧产生的总蛋白（1%O2)分离、SDS-PAGE分馏和放射自显影分析正常毒性培养物(A类)，并通过液体闪烁计数定量酸不溶放射性的相对量(B类). 普雷霉素（puro）处理常氧培养物3 h，为抑制蛋白质合成提供了阳性对照。(C类)缺氧72小时后，将EGFP阳性的再激活孔的百分比与常压培养物进行比较。Puro处理常氧培养物3小时，为诱导性再激活提供了阳性对照。
图4。
图4。
组成型活性4E-BP1阻遏物的诱导表达促进再激活。(A类)4E-BP1（AA）突变体对mTORC1介导的负调控无反应，并构成隔离eIF4E（4E），抑制cap依赖性mRNA翻译。（米7)米7GTP帽位于mRNA 5′端。用编码HA标记的4E-BP1野生型（WT）、AA或空载体的dox-inducible慢病毒转导潜伏感染神经元。在dox诱导后，通过免疫印迹法分析总蛋白，如图2B所示。黑色箭头位于左边面板的表示标记为4E-BP1的慢迁移（HA）；内源性4E-BP1迁移更快。(B类)从代谢标记为35S氨基酸持续3 h，并测定与空载体对照相比的放射性相对水平。(C类)dox诱导72h后收集RNA；用qRT-PCR定量ICP27 mRNA水平，并将其归一化为用空载体对照转导的培养物。雷帕霉素（100 nM）和二甲基亚砜处理的培养物没有用慢病毒转导，分别用作±再激活对照。误差条表示SEM(D类)如前所述，在ACV存在的情况下，建立了潜伏感染表达EGFP的HSV1的培养物，并用表达耗尽p70 S6K1或NS shRNA对照的shRNA的两种慢病毒（22904和3159）中的一种进行转导（Camarena等人，2010年；Kobayashi等人，2012年）。6天后，去除ACV，20小时后，分离总RNA。通过qRT–PCR定量ICP27 mRNA水平，如C类. (插入)神经元裂解物的免疫印迹验证S6K1沉默。Tubulin是一种负载控制。雷帕霉素作为阳性对照。
图5。
图5。
抑制轴突mTOR信号可触发隔离在神经元细胞体中的潜在基因组的重新激活。(A类)使用Boyden室插件创建“仅轴突”隔间。神经元被镀在顶部隔室中具有1微米孔的膜上。底部腔室中的高NGF会导致轴突通过孔生长到下腔室，形成一个单侧轴突。细胞体太大，无法通过毛孔。(B类)用免疫印迹法分析顶部和轴突区（±PP242）的裂解物。(C类)描述在DMSO或2.5μM PP242处理顶部腔室与仅轴突腔室后EGFP阳性孔百分比的再激活分析。该图代表了三个独立实验的集体分析，每个点都来自八个博伊登室。误差条表示SEM(插入)通过顶部腔室中细胞体的荧光成像检测到激活的神经元。(D类)用于分离染色体和轴突室的微流体装置示意图。神经元被画成绿色。相位和免疫荧光（Tau）图像显示轴突穿过分隔两个隔室的微槽。棒材，40μm。(E类)显示了对2.5μM PP242处理（±）1小时的体细胞与轴突细胞的EGFP阳性、再激活微流控室的比例。(*)P（P）≤ 0.0039.
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