LPA is a chemorepellent for B16 melanoma cells: action through the cAMP-elevating LPA5 receptor

doi:10.1371/journal.pone.0029260

.2011;6（12）：e29260。

doi:10.1371/journal.pone.0029260。 Epub 2011年12月14日。

LPA对B16黑色素瘤细胞具有化学驱避作用：通过cAMP升高的LPA5受体发挥作用

梅克尔·琼斯玛¹, 伊丽莎·马塔斯·里科, 阿德里安·雷扎德科夫斯基（Adrian Rzadkowski）, 基斯·贾林, Wouter H Moolenaar公司

附属公司

PMID： 22195035
预防性维修识别码： PMC3237609型
内政部： 10.1371/journal.pone.0029260

LPA对B16黑色素瘤细胞具有化学驱避作用：通过cAMP升高的LPA5受体发挥作用

梅克尔·琼斯玛等。公共科学图书馆一号. 2011.

.2011;6（12）：e29260。

doi:10.1371/journal.pone.0029260。 Epub 2011年12月14日。

作者

梅克尔·琼斯玛¹, 伊丽莎·马塔斯·里科, 阿德里安·雷扎德科夫斯基（Adrian Rzadkowski）, 基斯·贾林, Wouter H Moolenaar公司

附属

¹荷兰阿姆斯特丹荷兰癌症研究所细胞生物学部。

PMID： 22195035
预防性维修识别码： PMC3237609型
内政部： 10.1371/journal.pone.0029260

摘要

溶血磷脂酸（LPA）是一种富含血清的脂质介质，可刺激多种细胞类型的细胞迁移、增殖和其他功能。LPA作用于六个已知的G蛋白偶联受体，称为LPA（1-6），显示重叠和不同的信号特性。这里我们发现，出乎意料的是，LPA和血清几乎完全抑制B16黑色素瘤细胞的跨阱迁移，其中烷基-LPA（18:1）的效力是酰基-LPA（18%）的10倍。LPA的抗迁移反应是高度极化的，依赖于蛋白激酶A（PKA）而不是Rho激酶活性；它与细胞内cAMP水平的快速增加和质膜PIP3的缺失有关。B16细胞表达LPA（2）、LPA（5）和LPA（6）受体。我们发现LPA诱导的化学排斥反应是由烷基-LPA提呈LPA（5）受体（GPR92）特异性介导的，GPR92通过非经典途径升高细胞内cAMP。我们的研究结果将LPA（5）定义为一种抗迁移受体，并暗示cAMP-PKA通路以及减少的PIP3信号传导是B16黑色素瘤细胞化学排斥的效应物。

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利益冲突声明

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

**图1。LPA诱导的B16F10细胞迁移抑制。**
允许B16F10细胞通过纤维连接蛋白涂层的8µm多孔膜迁移3小时。**A–B类。**增加胎牛血清（FCS）浓度抑制细胞迁移(A类)或1-油酰基-LPA(B类). 中的插图B类显示了染色后的典型transwell过滤器。**C、。**如红色示意图所示，使用LPA（1µM）在上室或下室或在两个室中分析细胞迁移。D。B16F10细胞在LPC（1或5µM）存在下的迁移，在下室中添加或不添加重组autotaxin（ATX；10 nM）。**E.公司。**HGF（50 ng/ml）诱导的细胞迁移增强（趋化性）和LPA（1µM）的抑制作用增强。数值为至少三个独立实验的平均值±SEM，并归一化为非刺激细胞的迁移（***P<0.0001）。

**图2。LPA对ERK1/2活性和细胞增殖的影响。**
**答：。**LPA诱导B16F10细胞ERK1/2活化。使用抗ERK1/2和抗pERK1/2抗体对总ERK1/2和磷酸化ERK1/2（MAPK）进行蛋白质印迹分析。在指定的时间段内，用指定的LPA浓度刺激细胞。这些斑点是三个独立实验的代表。B。细胞于第0天在含有10%FCS的培养基中培养。16小时后，将细胞暴露于含有0.2%或2%FCS的培养基中，添加或不添加LPA（10µM）。LPA每24小时刷新一次，细胞计数一式三份。数值为平均值±SEM（N=5）。

**图3。聚赖氨酸和cAMP试剂对细胞迁移的影响。**
**答：。**LPA对多聚赖氨酸涂层膜上B16F10细胞的抑制作用。B。forskolin（25μM）和8-Br-cAMP（100μM）对B16F10细胞跨孔迁移的影响。**C、。**在存在或不存在LPA（1µM）的情况下，PKA抑制剂H-89（30μM）对细胞迁移的影响。数值为平均值±SEM（N=3；每个实验进行四次）（**P<0.001；***P<0.0001）。

**图4。LPA诱导B16细胞中cAMP和PIP3的变化。**
**A–B类。**LPA诱导cAMP变化的时间进程，使用基于FRET的传感器CFP-Epac-YFP进行监测。**答：。**单独CFP和YFP信号的时间进程（分别为蓝色和绿色）。B。CFP/YFP比率的增加反映了[cAMP]的增加（由于Epac展开导致FRET的损失[27]）。LPA，1µM；使用forskolin（10µM）校准响应。**C、。**从PH（GRP1）-GFP向胞浆的移位推断出LPA和沃特曼素诱导的质膜PIP3丢失的共焦图像。另请参阅视频S1。D。激动剂诱导的细胞溶质PH（GRP1）-GFP荧光增加，反映了质膜中PIP3的丢失。使用ImageJ软件定量荧光强度的动态变化（相对于非刺激性对照）。LPA，1µM；沃特曼，500 nM；α-MSH，1µM。

**图5。LPA证据₅介导细胞迁移抑制。**
**答：。**qPCR检测B16F10细胞中LPA受体的表达。GPR87是一种假定的LPA受体，有待验证。B。LPA的拆卸₅和LPA₆使用特定siRNA库进行表达（见材料和方法）。数值与GAPDH mRNA水平有关(A类)或百分比(B类). 数值为平均值±SEM（N=5）。**C、。**抗LPA siRNA转染B16F10细胞的迁移₅或LPA₆或非靶向siRNA（对照），无论是否存在LPA。相对值是两个独立实验的平均值（±SEM），每个实验都是四个实验（***P<0.0001）。D。通过增加1-油酰基-LPA和1-烷基-LPA浓度（18∶1）抑制细胞迁移。集成电路₅₀值：烷基-LPA（18∶1）～10 nM；LPA（18∶1）～100 nM。

**图6。LPA对LPA的趋化反应降低₅-转染HeLa细胞。**
**答：。**通过qPCR测定HeLa细胞中LPA受体的表达。GPR87是一种假定的LPA受体，有待验证。B。野生型或HA-LPA₅-转染的Hela细胞在有或无LPA（1µM）的情况下迁移24小时，如图所示。注意LPA的趋化性降低₅转染剂。将数值归一化为未刺激细胞的迁移（平均值±SEM；N=4）。

**图7。LPA介导的cAMP升高₅.**
如图所示，用LPA（1µM）和forskolin（10μM）刺激转染CFP-Epac-YFP的细胞。这些痕迹表明，随着CFP/YFP比率的增加，cAMP诱导的FRET（Epac的去折叠）损失。**答：。**用非靶向siRNA转染B16细胞。B。用抗LPA的siRNA转染B16细胞₅.D。野生型HEK293T细胞。**E.公司。**LPA转染HEK293T细胞₅。所有痕迹都代表至少三个独立实验。

**图8。α-MSH对cAMP和细胞迁移的影响。**
**A–B类。**如图所示，用α-MSH（1µM）、LPA（1μM）和forskoin（10μM）刺激表达CFP-Epac-YFP的B16F10细胞。**C、。**如图所示，当存在于上部或下部腔室中时，α-MSH抑制井间迁移。

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1. Chun J、Hla T、Lynch KR、Spiegel S、Moolenaar WH。国际基础和临床药理学联合会。第八十八条。溶血磷脂受体命名法。2010年版药理学；62:579–587.-项目管理咨询公司-公共医学
1. Eichholtz T、Jalink K、Fahrenfort I、Moolenaar WH。活性磷脂溶血磷脂酸是从活化的血小板中释放出来的。生物化学杂志，1993年；291（第3部分）：677–680。-项目管理咨询公司-公共医学
1. van Meeteren LA，Moolenaar WH公司。自趋化蛋白-LPA轴的调节和生物活性。《2007年血脂研究进展》；46:145–160.-公共医学
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[7] van Meeteren LA，Moolenaar WH公司。自趋化蛋白-LPA轴的调节和生物活性。《2007年血脂研究进展》；46:145–160.-公共医学

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