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.2011年11月；60(11):2892-902.
doi:10.2337/db11-0341。 Epub 2011年9月22日。

在原代胰岛β细胞中，通过钙依赖性钙调神经磷酸酶/NFAT信号介导葡萄糖诱导的胰岛素受体底物-2表达的特异性控制

达米安·德莫扎伊 1, Shin Tsunekawa先生, 伊莎贝拉·布里奥德, 拉米拉·沙阿, 克里斯托弗·罗兹
附属公司

在原代胰岛β细胞中，通过钙依赖性钙调神经磷酸酶/NFAT信号介导葡萄糖诱导的胰岛素受体底物-2表达的特异性控制

达米安·德莫扎伊等。 糖尿病. 2011年11月.

摘要

目标：胰岛素受体底物-2（IRS-2）通过促进生长和存活在胰岛β细胞中发挥重要作用。IRS-2在原代β细胞中的转换很快，但其表达在转录水平上受到高度调节，尤其是葡萄糖。目的是研究葡萄糖如何调节β细胞中IRS-2基因表达的分子机制。

研究设计和方法：将大鼠胰岛暴露于抑制剂或腺病毒载体介导的基因操作，然后通过实时PCR和免疫印迹分析葡萄糖诱导的IRS-2表达。用染色质免疫沉淀法分析活化T细胞转录因子核因子（NFAT）与IRS-2启动子的相互作用，用免疫组织化学法分析葡萄糖诱导的NFAT易位。

结果：葡萄糖诱导的IRS-2在体内胰岛β细胞中表达，但在肝脏中不表达。用硝苯地平调节大鼠胰岛β细胞Ca（2+）内流或去极化表明，葡萄糖诱导的IRS-2基因表达依赖于细胞外来源的细胞内钙浓度升高。钙调神经磷酸酶抑制剂（FK506、环孢霉素A和肽型钙调神经抑制剂[CAIN]）可消除葡萄糖诱导的IRS-2 mRNA和蛋白质水平，而组成活性钙调神经蛋白的表达可增加其水平。肽抑制剂VIVIT对NFAT的特异性抑制阻止了葡萄糖诱导的IRS-2转录。证实NFATc1在葡萄糖作用下向细胞核移位，并与IRS-2启动子中保守的NFAT结合位点相关。

结论：葡萄糖诱导胰岛β细胞特异性IRS-2基因表达转录控制的机制由Ca（2+）/钙调神经磷酸酶/NFAT途径介导。对IRS-2调节的这一认识可以为2型糖尿病提供新的治疗手段，以维持足够的功能性体重。

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数字

图1。
图1。
在胰岛中特异性葡萄糖诱导IRS-2表达的调节，但在体内肝细胞中没有。将正常C57Blk6/6J小鼠（12周龄）禁食过夜，然后进行腹腔葡萄糖耐量试验（2 mg/g体重）或使用生理盐水作为对照（42）。分离胰岛，在2小时和4小时时进行肝活检，然后进行免疫印迹（IB）分析IRS-2蛋白表达与PI3K（p85）的相关性，作为负荷对照。一：注射葡萄糖（●）或生理盐水（○）后，小鼠体内循环葡萄糖的漂移。显示平均值±SE(n个≥ 3).B类和C类：胰岛IRS-2和PI3K（p85）的IB分析示例(B类)和肝脏(C类)两个单独的实验显示，在2或4小时时，从盐水（S）或葡萄糖（G）处理的小鼠中提取。还描述了一系列实验的量化，其中灰色条表示S，黑色条表示G处理的动物。数据为平均值±SE(n个=3），其中*表示统计上的显著差异(P（P）≤0.05）。
图2。
图2。
β细胞中IRS-2表达的葡萄糖调节依赖于细胞溶质[Ca]的增加2+]我通量。将分离的大鼠胰岛在正常葡萄糖5.6 mmol/L下培养过夜，然后在基础葡萄糖3mmol/L下培养(灰色条)或刺激15 mmol/L(黑色条)在存在或不存在电压敏感性L型钙的情况下，葡萄糖浓度保持6小时2+-通道抑制剂硝苯地平（50µmol/L）(一和B类)或KCl使β-细胞去极化（30 mmol/L）(C类和D类).一和C类：通过实时荧光定量RT-PCR测量IRS-2和β-actin（内部参考对照）mRNA表达水平。数据显示为高于基础3 mmol/L葡萄糖控制的平均值±SE，其中*表示具有统计学意义的差异(P（P）≤0.05），在硝苯地平或KCl存在下葡萄糖浓度为15mmol/L时与对照组比较(n个≥ 4).B类和D类：通过免疫印迹分析IRS-2和PI3K（p85）（对照）蛋白表达水平。示例免疫印迹（IBs）如图所示。定量测量值也显示为平均值±SE，其中*表示15 mmol/L葡萄糖下与基础的3 mmol/L-葡萄糖对照组相比有统计学意义的增加，**表示硝苯地平在15 mmol/L葡萄糖下具有统计学意义的抑制，***表示在没有KCl的情况下，KCl相对于等效葡萄糖浓度的增强具有统计学意义(P（P）≤ 0.05;n个≥ 4).
图3。
图3。
β-细胞中IRS-2表达的葡萄糖调节由钙调神经磷酸酶介导。分离的大鼠胰岛在正常5.6 mmol/L葡萄糖下培养过夜，然后在存在或不存在钙调神经抑制剂FK506（10µmol/L）的情况下，在基础3 mmol/L或刺激性15 mmol/升葡萄糖浓度下培养6小时(一和B）或CsA（10µmol/L）(C类).一：通过实时荧光定量RT-PCR测量IRS-2和β-actin（内部参考对照）mRNA表达水平。B类和C类：通过免疫印迹分析IRS-2和PI3K（p85）（对照）蛋白表达水平，其中显示了一个示例免疫印迹（IB）。定量测量值也显示为高于基础3 mmol/L葡萄糖对照组的平均值±SE，其中*表示15 mmol/L葡萄糖下的统计学显著增加，**表示FK506或CsA与对照组在15 mmol/L-葡萄糖下的统计显著差异(P（P）≤ 0.05;n个≥ 4) (A–C). 分离的大鼠胰岛也感染了重组AdV-CAIN(D类和E类)，AdV CNca公司(F类和G公司)或AdV-FLuc，并在正常5.6 mmol/L葡萄糖下培养过夜。随后，将腺病毒感染的胰岛在基础浓度为3mmol/L或刺激浓度为15mmol/L的葡萄糖浓度下培养6小时。D类和F类：通过实时荧光定量RT-PCR测量IRS-2和β-actin（内部参考对照）mRNA表达水平。E类和G公司：通过免疫印迹分析IRS-2和PI3K（p85）（对照）蛋白表达水平，其中显示了一个示例免疫印迹。数据显示为高于基础3 mmol/L葡萄糖控制的平均值±SE，其中*表示在基础3 mmol/L葡萄糖之上15 mmol/L.葡萄糖时有统计学意义上的显著增加，**表示在15 mmol/L葡萄糖下AdV-CAIN对感染AdV-FLuc的对照胰岛有统计学意义的抑制，***表明，在各自的3和15 mmol/L葡萄糖浓度下，感染AdV-CNca的对照胰岛与感染AdV-FLuc的对照胰脏相比，在统计学上显著增加(P（P）≤ 0.05;n个≥ 4) (D类–G公司).
图4。
图4。
当NFAT被特异性抑制时，β细胞中IRS-2表达的葡萄糖调节降低。用表达NFAT特异性肽抑制剂AdV-VIVIT或AdV-FLuc的重组腺病毒感染分离的大鼠胰岛，并在正常5.6 mmol/L葡萄糖下培养过夜。随后，将腺病毒感染的胰岛在基础浓度为3mmol/L或刺激浓度为15mmol/L的葡萄糖浓度下培养6小时。一：通过实时荧光定量RT-PCR测量IRS-2和β-actin（内部参考对照）mRNA表达水平。B类：通过免疫印迹分析IRS-2和PI3K（p85）（对照）蛋白表达水平，其中显示了实例免疫印迹（IB）和定量测量。数据显示为高于基础3 mmol/L葡萄糖对照组的平均±SE，其中*表示在基础3 mmol/L葡萄糖之上15 mmol/L.时出现统计上显著的增加，**表示在AdV-VIVIT感染的对照胰岛中，与AdV-FLuc感染的对照岛相比，在15 mmol/L时出现统计学上显著的减少(P（P）≤ 0.05;n个≥ 4) (一和B类).
图5：。
图5：。
增加NFATc1的表达可增强β细胞IRS-2表达的葡萄糖调节。INS-1β细胞(一和C类)或分离的大鼠胰岛(B类和D类)用AdV-NFATc1或AdV-FLuc感染，并在正常5.6mmol/L葡萄糖下培养过夜。随后，将腺病毒感染的INS-1β细胞或胰岛在基础浓度为3mmol/L或刺激浓度为15mmol/L的葡萄糖浓度下培养6h。一和C类：通过实时荧光定量RT-PCR测量IRS-2和β-actin（内部参考对照）mRNA表达水平。数据显示为平均值±SE，其中*表示15 mmol/L葡萄糖高于基础3 mmol/L.葡萄糖时有统计学意义上的显著增加，**表示AdV-NFATc1感染的胰岛与AdV-FLuc感染的对照胰岛在各自的葡萄糖浓度下有显著增加(P（P）≤ 0.05;n个≥ 4).B类和D类：通过免疫印迹分析IRS-2和PI3K（p85）（对照）蛋白表达水平，其中显示了示例免疫印迹（IBs）。量化数据也显示为平均值±SE，其中*表示在基础3 mmol/L葡萄糖以上15 mmol/L-葡萄糖时有统计学意义上的显著增加，**表示AdV-NFATc1感染的胰岛相对于AdV-FLuc感染的对照胰岛在基础3 mm ol/L糖下有显著增加(P（P）≤ 0.05;n个≥ 4).
图6。
图6。
NFATc1在β细胞中与大鼠IRS-2基因启动子结合。一：预测大鼠IRS-2基因启动子上的NFAT结合位点元件。对大鼠IRS-2基因启动子从−3020到+1 bp（转录起始点）的检测显示多个NFATc1共识序列（GGAAA）。黑框（A–I）表示NFAT共识结合位点，箭头表示用于ChIP分析的五对引物。B类和C类：NFATc1与内源性大鼠IRS-2启动子的特异性结合。用AdV-NFATc1或AdV-Fluc作为对照感染INS-1β细胞，并使用抗NFATc1抗体或小鼠IgG作为阴性对照进行ChIP测定。输入(B类)对应于交联和剪切染色质。然后使用引物将DNA片段提交PCR扩增，以扩增IRS-2启动子中的五个区域，其中包括NFAT结合位点A、B和C，以及D、E或F到I，如上所示。PCR产物被加载到琼脂糖凝胶上，如图所示(B类). 进行了一系列ChIP分析(n个=6），组合数据显示为a区AdV-FLuc控制的平均值±SD，其中*表示显著增加(P（P）≤0.05）在AdV-NFATc1感染细胞与对照AdV-FLuc感染细胞中(C类).
图7。
图7。
葡萄糖诱导β细胞NFATc1从胞浆向细胞核移位。INS-1β细胞(一和C类)或隔离的大鼠胰岛(B类)在5.6 mmol/L葡萄糖下培养过夜，然后在基础3 mmol/L或刺激性15 mmol/L葡萄糖浓度下孵育6小时±FK506（10µmol/L）。一和B类：提取核蛋白，并通过与Maf-a相关的免疫印迹分析核NFATc1蛋白表达水平(一)或RNA聚合酶II（Pol-II）(B类)蛋白质表达作为负荷控制。显示了三个单独实验的免疫印迹（IB）示例。C类：NFATc1在INS-1胰腺β细胞中的细胞定位。NFATc1型(红色)通过免疫荧光和共焦显微镜对比胰岛素免疫染色（绿色）和DAPI细胞核染色分析定位(蓝色). 显示了三个单独实验的示例图像。（该图的高质量数字表示可在在线期刊上获得。）
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