An embryonic culture system for the investigation of striatal medium spiny neuron dendritic spine development and plasticity

doi:10.1016/j.jneumeth.2011.05.029

.2011年8月30日；200(1):1-13.

doi:10.1016/j.neumeth.2011年5月29日。 Epub 2011年6月13日。

纹状体中棘神经元-树突状棘发育和可塑性研究的胚胎培养系统

瑞秋·D·彭罗德¹, 萨伊德·库里奇, 埃丝特·卡尼, 马克·J·托马斯, 洛伦·拉尼尔

附属公司

PMID： 21672554
预防性维修识别码：项目经理3148294
内政部： 2016年10月10日/j.jnumeth.2011.05.029

纹状体中棘神经元-树突状棘发育和可塑性研究的胚胎培养系统

瑞秋·D·彭罗德等。神经科学方法杂志. 2011.

.2011年8月30日；200(1):1-13.

doi:10.1016/j.jneumeth.2011.05.029。 Epub 2011年6月13日。

作者

瑞秋·D·彭罗德¹, 萨伊德·库里奇, 埃丝特·卡尼, 马克·J·托马斯, 洛伦·拉尼尔

附属

¹明尼苏达大学神经科学研究生课程，地址：美国明尼阿波利斯教堂东南321号杰克逊大厅6-145号，邮编：55455。

PMID： 21672554
预防性维修识别码：项目经理3148294
内政部： 2016年10月10日/j.jnumeth.2011.05.029

摘要

纹状体中棘神经元（MSNs）的树突棘接受多巴胺能和谷氨酸能的汇聚输入。这些脊椎在反复给药后以及在亨廷顿氏病和帕金森氏病等疾病状态下经历经验依赖性的结构可塑性。因此，了解导致结构可塑的分子机制是建立脊椎结构和功能之间明确关系的重要一步，并将最终有助于理解树突棘结构的变化如何与行为或疾病相关。在研究MSN发育过程中面临的一个主要困难是缺乏一个详细的、标准化的体外模型系统，该系统能够产生具有活体形态的MSN。例如，与培养的锥体神经元不同，在单细胞培养中生长的MSN显示出树突树状化障碍，并且不能发育出完整的成熟树突棘群。在这里，我们报道了胚胎小鼠皮层-纹状体共同培养的一代，该培养能从单个胚胎中产生高细胞产量。与纹状体单细胞培养的MSN不同，共培养的MSNs以活体形态和高密度树突棘发育。表达可溶性荧光蛋白的共培养MSN的形态学鉴定可通过免疫化学检测DARPP-32（多巴胺和环AMP调节的32kDa磷酸蛋白）来证实。此外，共同培养的MSN脊髓含有PSD-95点，与SV2点相对，表明脊髓表达突触机制。最后，与单培养MSN相比，共培养MSN的全细胞记录显示出更高的mEPSC频率，这表明脊椎功能成熟。这些研究表明，该共培养系统适用于研究MSN树突棘的形态、生理发育和功能。

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图2
不同培养条件下MSN复杂性的比较。（A–D）单培养和共培养MSN的DARPP-32+染色样本图像。在这些图像中，荧光信号被反转，对比度增强，以提高能见度。箭头指向轴突。在Sholl分析所用的条件下，只有最靠近细胞体的轴突部分是可见的，因此对计数的贡献最小。（A） 14div单培养MSN，（B）14div共培养MSN。使用Sholl分析评估乔木复杂性。（E）该图显示了（C）中神经元轨迹上覆盖的同心环。在（F）14div和（G）21div处对交叉进行量化。在这两个时间点，共培养MSN比单培养MSN更复杂（在双向方差分析中，条件、距离和显著交互的主要影响显著；bonferroni post-hocs允许配对比较，*=p<0.05）。

图3
培养条件下树突棘密度和形态的比较。培养物在电镀前与pCAG-rtTA和pTRE-light-EGFP共同电穿孔，并通过在14div添加1μg/ml多西环素诱导表达。（A）在单培养（左）和共培养（右）中表达MSN树突的21div EGFP的代表性图像。重叠的圆圈表示不同形态类型的脊椎（T：薄，S：粗短，M：蘑菇）。比例尺=10μm。（B）在共培养条件下有明显更多的棘，共培养的MSN具有相对较高的高密度频率。（C）共同培养的MSN具有显著较大的脊柱头部和较长的脊柱颈部。对于（B-D），显示平均值±SEM，***=P<0.001。（D）薄棘、短棘和蘑菇型棘的相对频率。（E） Neuronstudio评估的形态学类型示意图，显示测量值（hd：头部直径，nl：颈部长度，nd：颈部直径）和Neuronstaudio使用的纳入标准。

图4
DARPP32+共培养MSN中突触前和突触后标记物的定位。最左边的列（A–D）显示DARPP32染色。（A-A〃）DARPP-32抗体染色填充树突轴和棘，并似乎与EGFP（A′，由pCAG-EGFP表达）共定位。DARPP32+树突状棘具有（B′）富含肌动蛋白的头部，与（C′）突触前SV2和（D′）突触后PSD95点相关，表明突触形态成熟。右栏显示左侧和中间面板的合并，DARPP32染色为红色，（a〃）EGFP、（B〃）F-肌动蛋白、（C〃）SV2或（D〃）PSD95染色为绿色。比例尺=1μm。

图5
单培养和共培养MSNs的基本电生理学特征。（A）分析突触传递。左侧，共培养的MSN（co，n=7细胞）与单培养的MSNs（mono，n=8细胞）相比，mEPSC频率明显更高，振幅更低。对，从单培养和共培养MSN中提取mEPSCs样本。校准：1 s，20 pA和200 ms，20 pA.每侧的下记录道显示一个上记录道部分的扩展扫描（持续1s）*p<0.05，**p<0.01。（B）固有兴奋性分析。左图为直接从录音设备拍摄的一个EGFP表达MSN的录制图像。右图，共培养MSN在13div（顶部，100、120、140、180和200 pA；中部，80、100、120，160和200 pC）和21div（底部，80、100120、140和160 pA）的样本痕迹。校准：500 ms，50 mV。

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