跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2011年3月30日；133(12):4274-84.
doi:10.1021/ja102581n。 Epub 2011年3月7日。

核磁共振波谱法测定金刚烷药物的特异性结合及其极性胺在流感M2跨膜结构域脂质双层和十二烷基磷酸胆碱胶束孔中的方向

莎拉·卡迪 1, 王军（Jun Wang）, 吴一冰, 威廉·F·德格拉多, 梅红
附属公司

核磁共振波谱法测定金刚烷药物的特异性结合及其极性胺在流感M2跨膜结构域脂质双层和十二烷基磷酸胆碱胶束孔中的方向

莎拉·卡迪等。 美国化学会志. .

摘要

流感M2蛋白（M2TM）的跨膜结构域形成了对病毒生命周期至关重要的四聚体质子通道。含胺金刚烷胺药物金刚烷烷胺和金刚乙胺可抑制质子通道活性，这些药物已被证明能与Ser31附近的M2TM孔特异性结合。然而，极性胺是否指向通道的N-或C-末端尚未确定。阐明极性基团的方向将阐明药物结合抑制质子通道的机制，并有助于合理设计新的抑制剂。在本研究中，我们使用脂质双层和十二烷基磷酸胆碱（DPC）胶束中重组的M2TM来确定极性胺的方向。（13） 对（13）C-标记的M2TM和甲基中和金刚乙胺在脂质双层中的C-（2）H旋转回波双共振NMR实验表明，极性胺指向通道的C末端，甲基接近Gly34。M2TM在DPC胶束中的溶液核磁共振实验表明，药物结合引起蛋白质的显著化学位移扰动，这与与脂质双层结合的M2TM和M2（18-60）的化学位移扰动非常相似。药物的特定（2）H标记允许分配药物蛋白交叉峰，这表明金刚烷胺和金刚乙胺以与双层结合M2TM相同的方式结合到孔。这些结果强烈表明，M2TM的金刚烷基抑制不仅通过直接物理阻断通道实现，还通过扰动质子传感残基His37的平衡常数实现。DPC胶束中与药理学相关的特异性孔结合位点的复制（在不同的洗涤剂DHPC中未观察到）强调了洗涤剂环境对该膜蛋白功能结构的重大影响。

PubMed免责声明

数字

图1
图1
第2天15在没有（a）和存在（b）2.5 mM WJ10的情况下，1 mM（单体浓度）M2TM（19-49）的N TROSY-HSQC光谱。在313 K下，在100 mM DPC胶束（50 mM磷酸钠，pH 7.5，10%D）中测量光谱2O和90%H2O） 在配备低温探头的Varian INOVA 600 MHz NMR上。药物结合后，信号在1H维以及线宽的改进线型和均匀性表明结合蛋白采用了良好的折叠构象。结合蛋白的分配被标记，插图显示了部分光谱的扩展视图。螺哌啶WJ10（IC）的化学结构50=0.92μM）如右侧光谱所示。相比之下，Amt有一个IC50=16微米。53
图2
图2
用Rmt滴定0.94 mM M2（19-49）（单体浓度）。来自15N个1H HSQC光谱绘制为Rmt浓度的函数。图a中，曲线在一种药物/四聚体的摩尔比下有明确的断裂，用蓝色表示。对应的滴定曲线预期药物在4种药物/三聚体络合物中紧密结合，用红色表示。图B显示了最小二乘拟合，其中化学计量和K（K）D类允许改变，如方法中所述。使用0.88±0.04药物/四聚体和K（K）D类=3.9微米。敏感性分析（图S1）表明K（K）D类在这些条件下小于或等于5μM，尽管不可能获得K（K）D类在这些条件下。在313 K、pH 7.5、DPC（蛋白质：DPC比1:50）、50 mM磷酸钠缓冲液中收集数据。
图3
图3
2D的Upfield区域13C编辑1200 ms混合的H NOESY光谱13C、，15标有N的VAG-M2TM，2等量（A）和Rmt（B）。左边的光谱是质子化药物的光谱，中间的光谱来自含有全氘化Amt和甲基中和Rmt的样品。右光谱是左光谱和中光谱之间的差异。（C） 显示NOE与M2交叉峰的质子在Amt和Rmt结构中以红色突出显示。分别在500 MHz和600 MHz光谱仪上记录（A）和（B）中的光谱。浓度为2 mM肽、100 mM DPC、1 mM Amt或Rmt和pH 7.5磷酸盐缓冲液，如图3所示。缬氨酸的甲基没有立体定向分配。（D） 从C末端看，M2TM晶体结构中通道孔中结合的Amt结构。球中显示的是Gly34 Cα（橙色）、Val27侧链（绿色）和Ala30侧链（青色）。疏水性金刚烷笼（品红）与Val27侧链广泛相互作用，而极性基团（蓝色）指向晶体结构中的C末端。
图4
图4
静态2d的H四极回波谱15-Rmt用于确定M2TM（残基22–46）通道中金刚烷笼相对于脂质双层的倾斜角。（a） d日15-Rmt在不含蛋白质的情况下与DMPC双层结合。（b） d日15-用1种药物/四聚体在DMPC双层中Rmt与M2TM结合。（c） d日15-Rmt用4种药物/四聚体与M2TM结合。（d） 在303K下，脂质双层中d15-Rmt的两个简并取向之一。（e）d的取向15-303 K时M2TM信道中的Rmt。
图5
图5
模拟2d的H光谱15-Rmt位于303 K。顶行：图5再现的实验光谱。最下面一行：模拟光谱。（a） d日15-Rmt与不含M2的DMPC双层结合。模拟中使用了4:1的大小耦合面积比，与金刚烷笼中赤道和轴向氘核的数量一致。（b） d日15-Rmt以1个药物/四聚体与M2结合。模拟光谱中36 kHz、13.3 kHz和各向同性成分的面积比为63%：27%：10%，代表孔隙结合、脂质结合和各向同性药物。（c） d日15-Rmt在4种药物/四聚体下与M2（22–46）结合。对于36 kHz、12.5 kHz和各向同性分量，模拟频谱的面积比为13%：83%：4%。
图6
图6
第2天15N个-13无Rmt和有Rmt的DMPC双层中Val27、Ser31、Gly34和Asp44标记的M2TM的C相关光谱。（a） 无毒肽的光谱。（b） 1种药物/四聚体样品的光谱。（c） 5种药物/四聚体样品的光谱。Ser31和Gly3415药物结合后，N化学位移增加，Val27 Cα化学位移减少。
图7
图7
13C类{2H} DMPC与CD结合M2TM的REDOR谱三-Rmt为5种药物/四聚体。控件之间的强度差异(S公司0，黑色）和退相光谱(S公司，红色）表示13氘化甲基的C-标记残基。（a） Val27 Cγ1的16.9 ms REDOR光谱显示不锈钢0= 1.02 ± 0.04. （b） 15.1 ms Ser31 Cα的REDOR光谱(不锈钢0=1.02±0.03）和Asp44 Cα(不锈钢0= 0.89 ± 0.03). （c） 18.8 ms时的Gly34 cαREDOR光谱不锈钢0= 0.81 ± 0.04. 差异光谱显示为蓝色。（d） 孔隙中金刚乙胺结构示意图，极性胺指向C末端，金刚烷笼倾斜约13°。
图8
图8
13C类{2H} 含CD的DMPC双层膜中M2TM的REDOR谱三-Rmt为1种药物/四聚体。（a） 15.1 ms REDOR光谱。不锈钢0Val27 Cγ1的值为1.2±0.16，Ser31 Cα的值为1.00±0.19，Asp44 Cα的值为0.92±0.08。（b） Gly34 Cα的16.9 ms REDOR光谱。不锈钢0= 0.94 ± 0.07.
方案1
方案1
CD的合成方案三-金刚乙胺和d15-金刚乙胺。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Cady SD、Luo WB、Hu FH、Hong M.生化。2009;48:7356–7364.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. 销至左侧，Lamb RA。生物化学杂志。2006;281:8997–9000.-公共医学
    1. GannagéM、Dormann D、Albrecht R、Dengjel J、Torossi T、Rämer PC、Lee M、Strowig T、Arrey F、Conenello G、Pypaert M、Andersen J、García-Sastre a、Münz C.细胞宿主微生物。2009;6:367–380.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. 施罗德C.亚细胞生物化学。2010;51:77–108.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Rossman JS、Jing X、Leser GP、Balannik V、Pinto LH、Lamb RA。《维罗尔杂志》。2010;84:5078–5088.-项目管理咨询公司-公共医学

出版物类型