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.2010年11月；12(11):1046-56.
doi:10.1038/ncb2108。 Epub 2010年10月24日。

Akt活化内皮细胞的血管分泌因子平衡造血干细胞的自我更新和分化

小林秀树 1, 杰森·巴特勒, 丽贝卡·奥唐纳, 小林真里子, 毕森鼎, 布莱恩特·邦纳, Vi K Chiu先生, 丹尼尔·诺兰, Koji Shido公司, 劳拉·本杰明, 沙欣·拉菲伊
附属公司

Akt活化内皮细胞的血管分泌因子平衡造血干细胞的自我更新和分化

小林秀树等。 Nat细胞生物学. 2010年11月.

摘要

内皮细胞建立了一个有指导意义的血管生态位，通过释放特定的旁分泌生长因子（称为血管分泌因子）重建造血干细胞和祖细胞（HSPC）。然而，内皮细胞平衡HSPC增殖速率和谱系特异性分化的机制尚不清楚。在这里，我们证明内皮细胞中的Akt激活通过mTOR的募集而非FoxO途径，上调了支持CD34（-）Flt3（-）KLS HSPCs扩张的特异性血管分泌因子，并具有长期造血干细胞（LT-HSC）的再增殖能力。相反，Akt刺激的内皮细胞与p42/44MAPK的共同激活将平衡转移到HSPCs的维持和分化。成年小鼠内皮细胞中Akt1的选择性激活增加了脾脏中的集落形成单位数和骨髓中具有LT-HSC活性的CD34（-）Flt3（-）KLS HSPC数，加速了造血恢复。因此，内皮细胞的激活状态通过血管分泌因子的调节调节HSPC的重建，Akt-mTOR激活的内皮细胞支持LT-HSC的自我更新和HSPC的扩张，而MAPK的共同激活有利于HSPC的维持和谱系特异性分化。

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竞争性金融利益：作者声明没有相互竞争的经济利益。

数字

图1
图1
建立Akt-或MAPK-激活的PEC。(一)pCCL的示意图。用于生成Akt和/或MAPK激活的内皮细胞的PGK慢病毒载体（顶部）和基因（底部）。用含有这些基因载体的慢病毒转导HUVEC。用转导的PECE4ORF1型被称为E4–PEC，用CA-Raf公司作为Raf–PEC，以及用二者转化的PECE4ORF1型和CA-Raf公司作为E4+Raf–PEC。E4–PEC和myrAkt–PEC代表Akt激活的PEC。Raf–PEC代表MAPK激活的PEC。PymT–PEC、KRas（V12）–PEC和E4+Raf–PEC代表激活Akt和MAPK的PEC。(b条)所示PEC的典型相位对比显微镜图像。(c（c）)不同PEC在无血清和生长因子培养基中的存活率。将汇合的细胞在无血清和生长因子的培养基中培养指定的天数。数据为平均值±标准差(n个=3），并表示为与0天表达eGFP的对照组相比的生长百分比。(d日)通过western blotting分析所示PEC中Akt和MAPK、ERK1和ERK2（ERK）的磷酸化。(e（电子）)通过试管形成试验测定血管生成活性。左：所示PEC的代表性相差显微镜图像。右：所示PEC形成的管道长度。数据为平均值±标准差(n个= 3). 斑点的未截取图像如补充信息图SXX所示。
图2
图2
Akt激活的PEC在扩增HSPCs方面比MAPK激活的PEC更有效。(一)林−细胞在指定的PEC上共培养20天以上，Lin−对细胞进行了测量。（b） CD34总数−飞行高度3−Lin共培养20天后的KLS HSPCs−带有指示PEC的电池。数据为平均值±标准差(n个= 3). (c（c）)KLS细胞群占扩增的造血细胞总数的百分比（Lin−和林+)与指定的PEC共培养10天后。数据为平均值±标准差(n个= 3). (d日)林的构成+在指定的PEC上共同培养后生成的细胞。(e（电子）)竞争性再种群分析。左：10000或1000 CD45.2 Lin−将细胞（在E4–PECs、E4+Raf–PECs或Raf–PECs上共培养）和500000个新制备的CD45.1竞争性全骨髓单核细胞移植到致命辐射小鼠中，并在3个月后通过抗体染色和外周血的FACS分析CD45.2细胞的移植物百分比。右：从移植小鼠血液中分离的细胞中CD45.1和CD45.2表达的代表性FACS点图。左上角显示了表达CD45.2的细胞百分比。不适用。；未测试。数据为平均值±标准差(n个=3，星号表示P（P）与移植Lin的小鼠细胞相比，<0.05−在E4–PEC上共同培养的细胞）。(（f）)左：10000 CD45.2 Lin−将共同培养在指定PEC上的细胞和500000个新制备的CD45.1竞争性全骨髓单核细胞移植到致死性辐射小鼠中，并通过FACS分析表达指定标记的造血细胞长期多系移植的百分比（4个月）。右：移植小鼠血液中分离细胞的Gr-1/CD11b和CD45.2表达的代表性FACS点图。数据为平均值±标准差(n个=3，星号表示P（P）与Lin移植小鼠的Gr-1/CD11b表达细胞相比，<0.05−在E4–PEC上共同培养的细胞）。(克)从长期植入的小鼠（如e（电子）)并移植到受致命辐射的二级受体中。在移植后8个月，通过FACS在第二受体中定量表达指示标记物的细胞的移植。数据为平均值±标准差(n个= 4,P（P）< 0.05).
图3
图3
热休克蛋白C在PEC上的扩张需要直接的细胞相互作用。(一)KLS细胞的细胞周期分析，在不同活化的PEC上扩增，不培养PEC，或从骨髓（新鲜BM）新鲜纯化。数据为平均值±标准差(n个= 3). 右图：通过FACS在所示PEC上共同培养的KLS细胞的细胞周期分析代表图，并用碘化丙啶（PI）处理以染色DNA。(b条)在指定的PEC上共同培养4天和7天的KLS HSPC的集落形成分析。(c（c）)与指定的PEC共培养7天后，对KLS细胞的CFU-GEMM和CFU-GM进行量化。(d、 e（电子）)不同PEC条件培养基对Lin产生的影响+单元格(d日)和CD34−飞行高度3−KLS HSPC扩建(e（电子）). 林老鼠−在E4–PEC、E4+Raf–PEC或对照血清和无生长因子X-vivo20培养基（载体）的条件培养基存在下，细胞与或不与E4–PE细胞共同培养8天。数据为平均值±标准差(n个= 3).
图4
图4
PEC的激活状态决定了HSPC活性基因的表达模式。(一)使用2404个探针对Akt-PEC（E4-PEC和myrAkt-PECs）和MAPK-PEC（Raf-PEC、K-Ras（V12）-PEC和E4+Raf-PECs）进行比较时差异超过2倍的基因进行层次聚类。热图中的红色和绿色表示与该特定基因的中位数相比，表达更高和更低，如右图所示。颜色强度与中间值（黑色）的差异有关。左侧显示了不同PEC的聚类。(b条)典型Akt或MAPK调节基因表达谱的变化。根据微阵列结果，基因在统计学上(P（P）<0.05），如图所示，Akt和MAPK（E4+Raf和K-Ras PEC）以及MAPK（Raf PEC）呈黄色或蓝色。这些值表明与对照eGFP相比，表达水平发生了翻倍变化+PEC。(c、 d、e)代表性Akt-显性基因的表达(FGF2组,IGFBP2型和DHH公司;c（c）)，MAPK显性基因(安哥拉2,IGFBP3型和IL6（IL6）;d日)和Notch配体(e（电子）)通过定量PCR对所示PEC进行定量。数据为平均值±标准差(n个= 3). (f–i)CD34扩建−飞行高度3−E4上的KLS HSPC–PEC，击倒IGFBP2型(（f）)或FGF2组(克)，以及E4+Raf–PEC，击倒Jagged-1型(小时)或安哥拉2(我). 通过定量PCR证实了击倒效果（补充信息，图S6a）。数据为平均值±标准差(n个=3，星号表示P（P）与对照组相比<0.05）。
图5
图5
内皮细胞中Akt-mTOR通路的激活促进HSPC的扩张。(一)Akt–PEC中mTOR抑制或FoxO1组成性激活对已知调节HSPC命运的一组特定基因表达谱的影响。E4–PEC用二甲基亚砜（对照）、20 nM雷帕霉素（rapa）处理，或用一个组成活性突变体转导福克斯O1(福克斯O1-TM). 总RNA用于Affymetrix微阵列基因芯片分析。由Akt激活调节的特定基因被列出并显示在热图中。与根据所有处理的特定基因强度值计算的中位数相比，热图图中的红色和绿色表示更高和更低的表达，如底部的刻度所示。颜色强度与中间值（黑色）的差异有关。(b条)雷帕霉素处理或过表达E4–PECs的微阵列结果福克斯O1-TM经定量PCR证实。代表的结果mTOR公司-从属的(数据链路1和DKK1（丹麦克朗）)和福克斯O1-从属的(安哥拉2)显示了基因。数据为平均值±标准差(n个= 3). (c（c）)mTOR公司western blotting证实了两种不同shRNA转染的敲除作用。(d日)mTOR调节基因的基因表达变化DKK1（丹麦克朗）（顶部）和IGFBP2型（底部）英寸mTOR公司击倒E4–PEC。数据为平均值±标准差(n个= 3). (e（电子）)CD34扩建−飞行高度3−KLS HSPC共同培养时mTOR公司-击倒（左）或福克斯O1-TM-过度表达（右）E4–PECs。数据为平均值±标准差(n个= 3). (（f）)竞争性再种群分析。CD45.2林−细胞（10000、3000或1000），培养在用对照扰乱序列shRNA转导的E4–PEC上，mTOR公司shRNA或用福克斯O1-TM将200000个新鲜制备的CD45.1竞争性全骨髓单个核细胞移植到致死性辐射小鼠体内，3个月后分析外周血。星号表示P（P）<0.05，与用对照加扰序列shRNA转导的E4–PEC相比。数据为平均值±标准差(n个= 3). 斑点的未截取图像如补充信息图SXX所示。
图6
图6
在成年小鼠中组成活性Akt1（myrAkt）的内皮特异性表达增加HSPC生成并加速造血。(一)在成年小鼠中用于以内皮细胞特异性方式控制组成型活性Akt1表达的四环素脱表达系统的示意图。顶部：我的Akt1转录由四环素反应元件启动子复合物控制（左）。内皮细胞特异性VE-cadherin启动子驱动四环素转换酶的表达（右）。底部：添加（左）或移除（右）四环素可用于控制我的Akt1. (b条)内源性总量Akt1公司（左）特别是我的Akt1通过定量PCR对野生型小鼠的整个骨髓（顶部）或脾脏（底部）中转基因（右侧）的表达进行定量和比较VEcad-tTA/Tet-myrAkt1公司小鼠停用四环素后。对于Akt1检测引物集，识别内源性Akt1公司和我的Akt1，而对于我的Akt1检测，仅识别我的Akt1采用转基因。数据为平均值±标准差(n个= 4). (c（c）)来自野生型和VEcad-tTA/Tet-myrAkt1公司在稳定状态下分析小鼠造血细胞（左上角）和CD34的绝对数量−飞行高度3−KLS HSPC（右上）。每10个KLS细胞的比率6脾细胞（左下）和CD34−飞行高度3−KLS HSPCs/106还分析了骨髓细胞（右下）。数据为平均值±标准差(n个= 5). (d日)用于量化野生型小鼠细胞的典型FACS点图（顶部）和VEcad-tTA/Tet-myrAkt1公司鼠标（底部）c（c）左：造血细胞的鉴定。显示了造血细胞的百分比。右：通过FACS进一步分析造血细胞以确定CD34−飞行高度3−细胞。CD34的百分比−飞行高度3−指示细胞。
图7
图7
Akt激活的内皮细胞支持成年小鼠短期和长期HSC的扩张。(一)用500000个来自野生型小鼠（WT）或VEcad-tTA/Tet-myrAkt1公司小鼠过度表达我的Akt1移植后10天，分析外周血白细胞（左）、红细胞（中）和血小板水平的恢复情况。数据为平均值±标准差(n个= 5). (b条)过度表达的小鼠脾脏我的Akt1分析脾脏集落形成单位（CFU-S）。数据为平均值±标准差(n个= 5). (c（c）)竞争性移植分析。对FVB小鼠进行致命照射。然后，这些小鼠接受了从野生型小鼠或VEcad-tTA/Tet-myrAkt1公司小鼠过度表达我的Akt1以及表达GFP的FVB小鼠的竞争性全骨髓细胞。三个月后，CD45+GFP公司−从外周血中移植的细胞总数中对细胞进行定量。(d日)用于量化c（c）CD45细胞的百分比+和GFP−显示在左上角。(e（电子）)用过表达小鼠的全骨髓细胞移植致死辐照小鼠的外周血样本中指示的移植细胞的鉴定和定量我的Akt1，移植后三个月。(（f）)用于量化e（电子）. (克)提出的通过血管小生境实现HSPC稳态的模型表明，内皮细胞的激活状态平衡了HSPC的扩增和分化。Akt激活的PEC（中间）主要通过产生典型的HSPC活性血管分泌生长因子（包括IGFBP2、FGF2、DHH和BMP4）和下调HSPC抑制因子（如DKK1和Ang2）来促进HSPC的维持和再生。相反，IGFBP2和FGF2（右）的下调以及成熟因子（如MAPK激活的PEC中的IL6）的上调有利于HSPC的分化。然而，在Akt-和MAPK激活的PEC（左）中，各种Notch配体的表达支持HSPC的长期维持，防止HSPC过度耗竭。通过血管生成性生长因子刺激Akt-和MAPK的激活程度可能决定HSPC的体内平衡。
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中的注释

  • HSPC处于平衡状态：血管生态位。
    博伊琳娜斯B，西普金斯DA。 Boyerinas B等人。 细胞干细胞。2010年12月3日；7(6):645-6. doi:10.1016/j.stem.2010.11.021。 细胞干细胞。2010 PMID：21112557 没有可用的摘要。

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