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.2011年1月21日；286(3):2132-42.
doi:10.1074/jbc。M110.148395。 Epub 2010年10月11日。

细胞命运决定因子Dachshund重组乳腺癌干细胞功能

吴孔明博士 1, 玄毛角, 李兆明, 桑杰·卡蒂亚尔, 马修·卡西米罗, 杨万才, 张琼（音）, 妮可·威尔马思, 伊乌里·切佩列夫, 马克·克罗萨里奥尔, 张伟, 胡俊波, 赵克吉, 理查德·佩塞尔
附属公司

细胞命运决定因子Dachshund重组乳腺癌干细胞功能

吴孔明博士等。 生物化学杂志. .

摘要

细胞命运决定因子Dachshund被克隆为过度活跃表皮生长因子受体椭圆的主要抑制剂。腊肠在人类乳腺癌中的表达缺失与预后不良相关。乳腺肿瘤起始细胞（TIC）可能有助于肿瘤进展和治疗抵抗。在TIC标记物高表达的乳腺癌细胞系和基础乳腺癌表型的患者样本中，内源性DACH1降低。DACH1的再表达减少了体内连续移植中新肿瘤的形成，减少了乳腺的形成，并降低了CD44（高）/CD24（低）乳腺肿瘤细胞的比例。相反，慢病毒shRNA对DACH1的作用增加了乳腺（B）TIC的数量。乳腺肿瘤的全基因组表达研究表明，DACH1抑制了与干细胞（SOX2、Nanog和KLF4）相关的分子特征，全基因组ChIP-seq分析确定DACH1与Nanog、KLF4和Lin28基因的启动子结合。KLF4/c-Myc和Oct4/Sox2拮抗DACH1对BTIC的抑制。力学研究表明，DACH1通过保守结构域直接抑制Nanog和Sox2启动子。内源性DACH1在体内外调节BTIC。

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数字

图1。
图1。
DACH1在人乳腺癌细胞系和乳腺癌组织中的表达。 A、 左侧面板Western blot检测乳腺癌细胞系DACH1丰度，β-actin作为负荷对照。右侧面板，乳腺癌细胞系中DACH1的mRNA表达正常化。B类乳腺癌细胞系CD24/CD44染色。C类，来自Oncomine数据库的规范化DACH1表达式。D类使用DACH1特异性抗体对正常乳腺上皮和三阴性侵袭性人类乳腺癌样本中DACH1表达的代表性图像和半量化。碱性钙基底型癌症。
图2。
图2。
DACH1阻断Met-1肿瘤生长体内并抑制与干细胞膨胀相关的特性。(一)用Flag标记的载体或DACH1表达载体转导Met-1细胞的Western blot和免疫组织化学。(B类)将等量的Met-1乳腺癌细胞与对照载体或DACH1表达质粒联合转导给裸鼠。植入裸鼠体内的Met-1细胞的肿瘤体积和肿瘤重量。对以下各项进行了分析n个= 5. 数据为平均值±SEM(C类)用载体或表达质粒转导Met-1细胞的系列植入研究。(D类)FACS显示从Met-1-GFP或Met-1-DACH1肿瘤分离的细胞的CD24/CD29双重染色（数据为平均值±SEM，n个= 5,第页< 0.001). (E类)用DACH1或DNA结合缺陷的DACH1突变体（DACHΔDS）转导的Met-1细胞的醛荧光染色。
图3。
图3。
DACH1降低CD24的比例低的/CD44型高的细胞。(一)用载体控制或DACH1转导的Met-1细胞的哺乳动物试验。(B类)基于FACS的Met-1细胞CD24/CD44双重染色在体外表达DACH1或控制载体。(C类)CD24的细胞潜能低的/CD44细胞高的 与CD24型高的/CD44型高的细胞测定。Met-1人群分析方法示意图。(D类)FACS分析。(E类)哺乳动物层形成和(F类)比较CD24的裸鼠肿瘤生长研究低的/CD44细胞高的和CD24高的/CD44细胞高的细胞。
图4。
图4。
内源性DACH1抑制干细胞表型。 一，通过慢病毒shRNA载体将内源性Dach1表达敲除至Dach1。B类表达shCTL或shDACH1的Met-1细胞的基于FACS的CD24/CD44双重染色和乳腺检测。C类表达shDACH1的Met-1细胞的乳腺数量和大小。数据为>5个实验的平均值±S.E。D类，FACS显示MCF10A和Myc转化MCF10A的CD24/CD44双重染色，用载体控制或DACH1。MCF10A转导细胞的Western blot。每种细胞类型也表达载体中的GFP作为标记。
图5。
图5。
路径分析。 一利用基因本体和KEGG通路集对表达DACH1或DAVID控制载体的Met-1细胞的微阵列数据进行通路分析。路径以图形方式表示为浓缩分数。红色表示上调和蓝色表示下调。B类，使用Sox2、Oct4或NOS（Nanog、Oct5和Sox2）的基因靶点对Met-1细胞的微阵列进行基因集富集分析，这些靶点在ES细胞中富集(一).C类，实时RT-PCR检测ES细胞相关基因表达（数据为平均值±S.E。，n个= 3).D类，CD24定量−/CD44细胞+多重转导的染色。E类、用编码KLF/c-Myc或Oct4/Sox2的病毒载体转导的Met-1细胞的FACS分析。
图6。
图6。
DACH1抑制Sox2和Nanog转录。(一)选定基因启动子的DACH1依赖性标记密度。箭头指示转录的起始位置和方向。(B类)Sox2和(C类)Nanog启动子使用Met-1细胞表达标记的DACH1或控制GFP载体。指向启动子的寡核苷酸探针的示意图。(D类)荧光素酶报告基因检测Sox-2和(E类)纳克DACH1野生型或保守DS结构域的突变体被联合转染。数据为平均值±SEMn个=6次单独转染(第页< 0.001).
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