Identification of interacting hot spots in the beta3 integrin stalk using comprehensive interface design

doi:10.1074/jbc.M110.170670

.2010年12月3日；285(49):38658-65.

doi:10.1074/jbc。M110.170670。 Epub 2010年10月7日。

利用综合界面设计识别β3整合素柄中的相互作用热点

杰森·唐纳德¹, 华珠, 鲁斯特姆·利特维诺夫, 威廉·F·德格拉多, 乔尔·本内特

附属公司

PMID： 20929856
预防性维修识别码： PMC2992298型
内政部： 10.1074/jbc。M10.170670型

利用综合界面设计识别β3整合素柄中的相互作用热点

杰森·唐纳德等。生物化学杂志. 2010.

.2010年12月3日；285(49):38658-65.

doi:10.1074/jbc。M110.170670。 Epub 2010年10月7日。

作者

杰森·唐纳德¹, 华珠, 鲁斯特姆·利特维诺夫, 威廉·F·德格拉多, 乔尔·本内特

附属

¹宾夕法尼亚大学医学院生物化学和生物物理系，费城，宾夕法尼亚19104，美国。

PMID： 20929856
预防性维修识别码： PMC2992298型
内政部： 10.1074/jbc。M10.170670型

摘要

蛋白质-蛋白质界面通常是大而互补的表面，但代表能量“热点”的特定侧链通常对结合自由能的贡献不成比例。我们使用了一种计算方法，即综合界面设计，确定β3的柄区与互补的αIIb和αv整合素亚基之间的界面热点。使用Rosetta丙氨酸扫描和设计算法预测β3区域从残基Lys（532）延伸到Gly（690）的失稳、稳定和中性突变，我们预测了8个会破坏αIIbβ3界面的丙氨酸突变，以及9个会破坏βvβ3界面稳定性的丙氨酸变异，突变分布广泛且不均匀，在552和563残基之间有4个突变，在590和610残基之间5个突变，但在565和589、611和655残基之间没有突变。此外，破坏αvβ3和αIIbβ3界面稳定性的突变并不相同。然后通过在中国仓鼠卵巢细胞中表达的全长整合素中引入选定的突变来测试预测。有五种突变预测会破坏αIIb和β3的稳定性，导致纤维蛋白原与αIIbβ3结合，而四分之三的突变预测为中性或稳定。相反，预测破坏αvβ3而非αIIbβ3（D552A）稳定性的突变导致骨桥蛋白与αvβ2结合，而纤维蛋白原与αIIb？3结合。这些结果表明，远端柄界面的稳定性与整合素在稳定、非活性构象中的约束有关。此外，他们证明了综合界面设计识别功能显著的整合素突变的能力。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
**αIIbβ3从静息低亲和力构象向活性高亲和力构像转变的模型，说明静息构象中远端αIIb和β3柄之间存在接触。**TM域是*螺旋线*位于底部αIIb如所示绿色，β3英寸青色这些模型基于大量的证据，即活化将αIIbβ3从弯曲分子转化为延伸分子（4，6），包括我们自己的旋转阴影电子显微镜图像，其中αIIb？3与纤维蛋白原结合，其中αⅡb？3通过分离的柄完全延伸（3，6）。尽管如此，也有证据表明弯曲构象中的整合素能够与配体相互作用（8）。

**图2。**
**取代β3残基Lys的计算效果⁵³²–甘氨酸⁶⁹⁰分别与丙氨酸结合自由能（Δ*G公司*)β3茎和αIIb茎(*实心钢筋*)和αv(*开放式酒吧*).** 箭头指出β3突变的位置，其对αIIbβ3和αvβ3功能的影响随后进行了研究。

**图3。**
**设计的β3突变在αIIb和β3柄界面的位置。**Zhu报道的晶体结构中显示了7个突变的β3残基等。(4). αIIb柄如所示绿色β3秸秆青色. The盒图中显示了突变WT残基的侧链*黄色球体*丙氨酸突变被预测为不稳定和中性*有字母的*在里面*红色和绿色*。当突变为色氨酸时，预计会稳定的残基表示为*黑色字体*.

**图4。**
**纤维蛋白原与表达含有β3柄突变的αIIbβ3的CHO细胞结合。**Alexa Fluor 488纤维蛋白原与αIIbβ3的结合在缺乏（组成结合）或存在（刺激结合）5 m的情况下通过流式细胞术进行测量米DTT公司。如“实验程序”所述，使用纤维蛋白原结合测量值计算每个突变相对于WT的纤维蛋白原绑定指数。所示数据为平均值±S.E(*误差线*)三到六次测量。

**图5。**
**通过基于激光镊子的破裂力光谱测定β3柄突变对OPN与αvβ3结合的影响。**按照“实验程序”所述，测量涂有OPN的乳胶珠与表达WTαvβ3或含有β3突变D552A和V664A的αvβ3CHO细胞之间的破裂力一，直方图显示了在缺乏αvβ3激活剂的情况下，OPN涂层珠和表达αvβ3-的CHO细胞之间的破裂力分布(*组织的*)，在αvβ3特异性拮抗剂存在下100μ米XJ735，在αvβ3激活剂存在下1 m米锰²⁺测量的破裂力被分类为直方图，并通过珠状电池接触总数进行归一化。特定力范围内的事件百分比（bin）表示该范围内的键断裂频率百分比。B类，根据αvβ3表达水平归一化，在所述条件下，OPN涂层珠和表达αvβ3-的CHO细胞之间检测破裂力>10 pN的累积概率一所示数据为平均值±S.D(*误差线*)共15–40个实验文件。*，t吨统计学显著性检验：D552A与重量，第页= 0.02043; V664A型与重量，第页= 0.0076.

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