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.2010年9月2日10:473。
doi:10.1186/1471-2407-10-473。

神经母细胞瘤中p21Waf1的表达受核中间丝波形蛋白调控

Xénia Mergui公司 1, Marie-Line监狱, 多米尼克·瓦尔特阿·库亚内特（Dominique Valteau-Couanet）, 马克·利平斯基, 让·贝纳德, 穆尼拉·阿莫尔·古雷特
附属公司

神经母细胞瘤中p21Waf1的表达受核中间丝波形蛋白调控

Xénia Mergui公司等。 BMC癌症. .

摘要

背景：人类神经母细胞瘤（NB）细胞系可能存在所谓的S和N亚型之一。我们以前曾报道过S亚型标记物波形蛋白的蛋白表达水平与p21Waf1细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂之间的强烈相关性。我们在这里研究了这种相关性是否延伸到NB细胞系和患者肿瘤中的mRNA水平。我们还通过询问波形蛋白是否可以调节p21的表达，进一步探讨了波形蛋白表达与p21之间的关系。

方法：使用Q-PCR对NB细胞系以及患者肿瘤（n=77）中的波形蛋白和p21 mRNA水平进行定量。采用Log-rank-Kaplan-Meier估计法分析40例高危NB患者肿瘤Q-PCR数据与总生存率的关系。分别使用siRNA-介导的波形蛋白高表达或低表达细胞系中波形蛋白的缺失或过度表达，然后进行蛋白质表达和启动子激活分析，以评估波形蛋白在调节p21表达中的作用。

结果：我们将波形蛋白和p21表达之间的显著相关性扩展到NB细胞系和患者肿瘤中的mRNA水平。从高危患者肿瘤中获得的Q-PCR数据进行的总体生存分析表明，p21表达水平较低可能与较差的预后相关。我们的数据还表明，p21和波形蛋白表达水平之间的相关性是由波形蛋白调节p21转录活性所致。事实上，下调波形蛋白导致p21 mRNA和蛋白表达以及p21启动子活性显著降低。相反，波形蛋白的过度表达触发了波形蛋白核表达细胞中p21启动子活性的增加。

结论：我们的结果表明，p21 mRNA肿瘤表达水平可以代表高危NB患者的精确预后因素。我们的数据还表明波形蛋白调节p21转录；这是首次证明这种III型中间丝的基因调节功能。

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数字

图1
图1
NB细胞系和肿瘤中波形蛋白21 mRNA的相关性——p21表达与临床演变的相关性A.波形蛋白的mRNA定量(左侧面板)和第21页(右侧面板)在10个高危NB细胞系中，使用Sybr Green Q-PCR，GAPDH正常化后的相对表达水平。显示NB细胞系的S或N亚型。该结果在EF1α归一化和TaqMan Q-PCR定量后得到证实，使用两个不同的基因进行归一化（18S和TFRC）（数据未显示）。条形图和误差条形图分别表示平均值和标准偏差。B.在诊断时收集的77个NB肿瘤样本（原发性肿瘤活检或转移性骨髓，均含有70%以上的肿瘤细胞）中，根据波形蛋白的p21 mRNA相对表达水平的表达，在18S标准化后通过Sybr Green Q-PCR定量（临床数据见附加文件1表S1）。使用SK-N-SH细胞系的cDNA样本作为参考，将所有数据整合到一个独特的分析中。Spearman统计测试使用Graph Pad Prism软件版本4.0进行。CI：置信区间。C、。左侧面板：在队列中的40例高危NB肿瘤样本中，p21 mRNA相对表达水平根据波形蛋白表达水平表示，并在18S标准化后通过TaqMan Q-PCR进行量化。斯皮尔曼统计测试与1B时一样进行。这一结果是使用Sybr-Green或TaqMan技术获得的，两个标准化基因分别为18S和GAPDH，或18S和TFRC（数据未显示）。右侧面板：使用Graph Pad Prism软件4.0版的Log-rank Kaplan-Meier估计值对年龄大于1岁的4期NB患者（N=40）进行生存分析。总生存率定义为诊断到死亡或最后一次随访之间的时间（不包括因中毒死亡的患者）。根据Q-PCR定量的p21 mRNA肿瘤相对表达水平，将患者分为两组，如左图所示。p21肿瘤表达的中位数被选为高表达（>中位数，黑线）和低表达（<中位数，灰线）之间的分界点。HR：危险比，CI：置信区间。
图2
图2
波形蛋白参与p21转录调控A.通过Q-PCR分析监测波形蛋白或p21基因的表达(上部面板)，如图1A所示。通过免疫印迹法评估总细胞提取物中的波形蛋白或p21蛋白水平，α-管蛋白用作负荷控制(下部面板). 细胞未经转染（Unt.）或转染以波形蛋白为靶点的siRNA（siVIM）或对照siRNA（siCTRL）。细胞未经处理（-）或NCS处理（+）。该图代表了3个独立实验。NCS：新卡司他丁。B.在SK-N-SH、CHP-212、GI-MEN、SJN-B1和Kelly细胞系中，通过差异分级（C，细胞质；N，核）和Western blot分析评估可溶性波形蛋白的亚细胞定位。拓扑异构酶IIα和α-管蛋白分别用作核质可溶部分的对照。C.使用荧光素酶分析法分析所示S或N型NB细胞系中p21启动子的活性，波形蛋白表达下调（siVIM）或不下调（siCTRL）（上面板）或过表达（pcDNA3.1-VIM）或不表达（CTRL:pcDNA3.1）波形蛋白（下面板）采用Mann-Whitney统计检验进行比较（*和***分别代表p<0.05和p<0.005）。该图代表了3个独立实验。D。上部面板：Western Blot分析暂时转染pcDNA3.1-VIM或空载体（pcDNA3.1）的指示细胞中波形蛋白的表达。β-肌动蛋白作为负载对照。下部面板：波形蛋白过度表达细胞中的波形蛋白细胞分布（C，细胞质可溶；N，核可溶；Ins.，不溶性细胞骨架/基质相关组分），通过差异细胞分馏和Western Blot分析进行评估。拓扑异构酶IIα和α-管蛋白分别用作核质可溶部分的对照。
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