Anaplasma phagocytophilum AptA modulates Erk1/2 signalling

doi:10.1111/j.1462-5822.2010.01516.x

.2011年1月；13(1):47-61.

doi:10.1111/j.1462-5822.2010.01516.x。 Epub 2010年8月27日。

无浆吞噬细胞AptA调节Erk1/2信号

宾杜·苏库马拉¹, 朱利安娜·马斯特罗伦齐奥, Sukanya Narasimhan公司, 莎拉·范库泽（Sarah Fankhauser）, Pradeep D Uchil公司, 罗伊·利维, 莫文·格雷厄姆, 托尼亚·米歇尔·科尔皮特斯, Cammie F Lesser系列, 埃罗·菲克里格

附属公司

PMID： 20716207
预防性维修识别码：项目经理3005019
内政部： 10.1111/j.1462-5822.2010.01516.x号

无浆吞噬细胞AptA调节Erk1/2信号

宾杜·苏库马拉等。细胞微生物学. 2011年1月.

.2011年1月；13(1):47-61.

doi:10.1111/j.1462-5822.2010.01516.x。 Epub 2010年8月27日。

作者

宾杜·苏库马拉¹, 朱莉安娜·马斯特龙齐奥, Sukanya Narasimhan公司, 莎拉·范库泽（Sarah Fankhauser）, Pradeep D Uchil公司, 罗伊·利维, 莫文·格雷厄姆, 托尼亚·米歇尔·科尔皮特斯, Cammie F Lesser系列, 埃罗·菲克里格

附属

¹美国康涅狄格州纽黑文市耶鲁大学医学院内科传染病科，邮编06520-8022。

PMID： 20716207
预防性维修识别码：项目经理3005019
内政部： 10.1111/j.1462-5822.2010.01516.x号

摘要

吞噬细胞无浆体引起人类粒细胞无浆症，是北美洲最常见的蜱传疾病之一。这种不寻常的专性细胞内病原体选择性地存在于多形核白细胞内。在本研究中，使用酵母替代模型，我们鉴定了一种吞噬细胞A.吞噬细胞毒性蛋白AptA（A.吞噬细胞A.毒素A），该蛋白激活哺乳动物Erk1/2有丝分裂原活化蛋白激酶。这种激活对人类中性粒细胞内吞噬细胞的存活至关重要。AptA与中间丝蛋白波形蛋白相互作用，波形蛋白对A.吞噬细胞诱导的Erk1/2活化和感染至关重要。A.吞噬细胞感染重组细菌包涵体周围的波形蛋白，从而促进细胞内存活。这些观察结果揭示了细菌蛋白AptA和宿主蛋白波形蛋白在吞噬细胞a.感染期间Erk1/2激活中的主要作用。

PubMed免责声明

数字

图1
AptA的表达减弱真核细胞的生长。（A）在48小时时，对含有GFP-AptA或载体GFP的酵母细胞进行成像，这些细胞在非还原葡萄糖或诱导半乳糖中以10倍的连续稀释液生长。（B）当AptA从高拷贝（HC）、低拷贝（LC）或无标记载体表达时，酵母细胞的生长。*嗜肺军团菌*IV型效应器YlfA（酵母致死因子A）被用作抑制的阳性对照。结果表示为归一化为矢量控制的三份样品的平均值±SD。（C）提取的总RNA的RT-PCR分析*A.吞噬细胞*-感染的HL-60细胞（泳道1）或感染的蜱唾液腺在传播（tick-I-Tra，泳道2）和获得（tick-I-Acq，泳道3）过程中表明*A.吞噬细胞*在其感染周期内。（D） Western blot分析表明，AptA表达于*A.吞噬细胞*感染后24小时在HL-60细胞中。AptA前免疫血清显示为阴性对照。（E）通过48小时时测定的BrdU增殖试验，AptA的表达导致HEK293细胞的增殖减少，用三份样品的平均值±SD表示。*，第页<0.05（非配对双尾检验）。

图2
AptA本地化。（A） GFP-AptA在诱导后8小时定位于酵母的质膜。缺失N端60个氨基酸（GFP-AptA-DN60）而非C端（GFP-AptA-DC60），可消除AptA的膜定位。诱导8小时表达对照GFP的细胞显示GFP定位于细胞质。（B） Western blot显示使用GFP抗体在表达GFP-AptA的酵母细胞中表达AptA。UI-total=未诱导总裂解液，I-total=诱导总裂解物，蛋白质的表达由半乳糖诱导。表达GFP-AptA的酵母细胞的生化分级表明，AptA存在于酵母裂解物的质膜部分（I-PM）中。（C）和（D）表明，AptA分别定位于HL-60和RF/6A细胞的质膜和点状细胞质斑点。在pC1EGFP载体中用AptA转染细胞，并在转染后24小时进行表达分析。与酵母相似，N端60个氨基酸（GFP-AptA-DN60）的缺失，而非C端（GFP-AptA-DC60）的删除，消除了AptA在HL-60细胞（E）中的膜定位*A.吞噬细胞*夹杂物。用GFP-AptA（绿色）转染RF/6A细胞，并用mCherry感染-*A.吞噬细胞*（红色）24h，免疫荧光分析。（F）内源性表达的AptA定位于*A.吞噬细胞*.RF/6A细胞感染mCherry-*A.吞噬细胞*（红色）用抗AptA多克隆抗体（绿色）固定免疫染色48h。白色箭头表示包涵膜上的AptA。AptA免疫前对照血清未染色*A.吞噬细胞*-感染的RF/6A细胞。（G） RF/6A细胞内源性表达AptA的时间进程分析。感染后12小时左右，几乎无法检测到AptA（绿色）表达*A.吞噬细胞*（红色），但在感染后24小时和48小时，AptA定位于包膜。（H）免疫电镜成像（使用抗AptA抗体）显示AptA在*A.吞噬细胞*-受感染的HL-60细胞。黑点对应AptA。棒材，0.2µm。

图3
AptA激活MAP激酶途径并与波形蛋白相互作用。（A）和（B）表明，AptA激活酵母细胞壁完整性MAP激酶途径。（A）表达AptA的酵母细胞（诱导后4小时）的Western blot显示Mpk1/Slt2磷酸化，即细胞壁完整性途径的MAPKAptA（无诱导）和+AptA。（B） AptA激活Rlm1调节的β-半乳糖苷酶报告子。在诱导后的0、2和4 h，对含有Rlm1-βgal报告子结构和AptA或对照载体的酵母细胞进行检测。结果表示为三次试验的平均值±SD。*，第页<0.05（非配对双尾检验）。**，第页<0.01（非配对双尾检验）。（C） AptA通过Mek1/2激活哺乳动物细胞中的Erk1/2 MAPK通路。转染后24小时，用转染GFP-AptA和载体GFP的HL-60细胞裂解液上的pErk1/2和pMek1/2抗体进行Western blot。非磷酸化Erk1/2和Mek1/2被用作对照（D），AptA的N端28个氨基酸是激活Erk1/2所必需的。将HL-60细胞转染AptA全长（完整）、载体GFP（GFP）、N端28氨基酸缺失（DN28）、N末端60氨基酸缺失（DNA 60）和C端60氨基酸缺失突变（DC60）24 h。（E）从AptA-GFP、DN60、DC60或载体GFP转染的HEK293细胞中免疫沉淀波形蛋白，然后用抗AptA抗体进行检测，结果表明AptA与AptA-GFP和DC60中的波形蛋白共免疫沉淀，但与载体GFP和DN60转染的样品没有共免疫沉淀。用抗AptA抗体检测总裂解物（输入），以显示AptA-GFP、DN60或DC60转染细胞中AptA的表达。（F） AptA和波形蛋白共定位*A.吞噬细胞*包裹膜。感染的RF/6A细胞或中性粒细胞*A.吞噬细胞*72小时或3小时后，N对波形蛋白（绿色）和AptA（红色）进行免疫染色。感染的（I）RF/6A细胞和经同种抗体处理的中性粒细胞被用作阴性对照。

图4
波形蛋白参与Erk1/2的激活*A.吞噬细胞*感染。（A） Erk1/2在*A.吞噬细胞*哺乳动物细胞感染。Erk1/2激活的Western blot分析*A.吞噬细胞*分别在感染后48小时和3小时感染HL-60细胞和中性粒细胞（N。UI（未感染细胞），I(*A.吞噬细胞*-感染细胞）。（B）细菌内化是*A.吞噬细胞*–诱导Erk1/2激活。Western blot显示，与未经处理的细胞（−cyto）相比，经细胞松弛素D（+cyto）预处理的HL-60细胞感染未能激活Erk1/2。（C）使用U0126抑制MEK1/2可在*A.吞噬细胞*人类中性粒细胞感染。用U0126（20µM）（I+U0126）或对照DMSO（I）处理中性粒细胞，并感染*A.吞噬细胞*3小时后，对裂解产物进行磷酸化Erk1/2的分析。（D–I）表明波形蛋白参与Erk1/2磷酸化*A.吞噬细胞*感染。（D）显示Erk1/2磷酸化在*A.吞噬细胞*波形蛋白感染使HL-60细胞沉默。（E）显示Erk1/2磷酸化在*A.吞噬细胞*用维他福林A治疗中性粒细胞感染。（F） MEK1/2抑制减少*A.吞噬细胞*人类中性粒细胞感染。用载体（DMSO）或抑制剂U0126处理中性粒细胞并感染*A.吞噬细胞*.分离总RNA并进行qRT-PCR以测量*A.吞噬细胞*，并且用对应于β-肌动蛋白的值对值进行归一化。结果通过使用DMSO对照样品值（三次试验的平均值±SD）进行归一化表示。（G）波形蛋白沉默导致*A.吞噬细胞*HL-60细胞感染，48小时后用qRT-PCR分析。的级别*A.吞噬细胞*用β-actin对应的值进行标准化。结果通过非靶向siRNA处理的对照样品值的标准化表示，来自三次实验的平均值±SD。（H）维他福林A治疗引起的波形蛋白沉默减少*A.吞噬细胞*中性粒细胞感染，qRT-PCR分析。的级别*A.吞噬细胞*用β-actin对应的值进行标准化。结果通过使用DMSO（载体）处理的对照样品值进行归一化表示，三次试验的平均值±SD。（一） Erk1/2抑制和波形蛋白沉默不影响*A.吞噬细胞*内部化。在Erk1/2抑制和波形蛋白沉默后，在免疫训练后的早期（感染后4小时）通过显微镜分析内化细菌的数量。的数量*A.吞噬细胞*计算每100个宿主细胞，结果显示为来自三个重复孔的平均值±SD，是两个具有类似结果的独立实验的代表。*，第页<0.05（非配对双尾检验）。**，第页<0.01（非配对双尾检验）。

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