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.2010年9月24日；285(39):30170-80.
doi:10.1074/jbc。M110.137562。 Epub 2010年7月27日。

人工膜系统中CD44-透明质酸相互作用的分析：高、低分子量透明质酸不同结合特性的见解

帕特里夏·M·沃尼 1, 苏尼尔·巴纳尔吉, 塞琳·古诺, 阿兰·布里森, 安东尼·戴伊, 大卫·G·杰克逊, 拉尔夫·里希特
附属公司

人工膜系统中CD44-透明质酸相互作用的分析：高、低分子量透明质酸不同结合特性的见解

帕特里夏·M·沃尼等。 生物化学杂志. .

摘要

CD44是大分子多分散糖胺聚糖透明质酸（HA）的主要细胞表面受体。长而灵活的HA链的结合被认为是由糖分子的多价性质所稳定的。此外，高分子量和低分子量HA在与CD44结合时会产生明显的促炎和抗炎作用，并可在适当的细胞类型中传递增殖或抗增殖信号。然而，尽管这种相互作用很重要，但细胞表面多价HA结合的化学计量学和不同HA大小类别之间功能区分的分子基础都不清楚。在这里，我们报道了一种支持的脂质双层系统的设计，该系统允许通过以稳定、天然定向的方式和在受控密度下呈现CD44来定量分析多价结合。使用该系统结合生物物理技术，我们发现HA与CD44致密涂层双层的结合量随着HA大小的增加而增加，在～30 kDa时达到半最大饱和度。此外，可逆结合仅限于较小的HA物种（分子量≤10kDa），而与较大聚合物的相互作用基本上是不可逆的。结合HA的量随着受体表面密度的降低而减少，但结合稳定性不受影响。从物理化学角度来看，HA的结合特性与柔性聚合物的典型行为有许多相似之处，因为HA吸附在均匀吸引的表面上。这些发现为CD44-HA相互作用的多价性提供了新的见解，并为不同粒级透明质酸的不同生物学特性提供了分子基础。

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数字

图1。
图1。
A类，人类CD44的示意图，嵌入质膜。这个插入显示了透明质酸结合域与HA八糖（13）复合物的晶体结构（蛋白质数据库代码2JCR），其中蛋白质显示为带状图，二硫键描述为黄色球体，HA位于木棍表示法。B类和C类，模型系统设计的示意图。B类，模型系统1，基于（HABD）2-Fc.公司。C类，模型系统2，基于His-HABD。
图2。
图2。
A类，逐步组装模型系统1，然后进行QCM-D。指示所有孵育步骤的开始和持续时间(箭头). 将50μg/ml由DOPC和DOPS（3:1）制成的SUV涂布到二氧化硅表面，形成SLB。两相行为以及频率的最终变化(圈子)Δ的（f）=−25 Hz且耗散(正方形)Δ的D类< 0.3 × 10−6描述形成高质量SLB的特征（36，39）。10μg/ml AnxA5-Z和10μg/ml（HABD）连续培养的反应2-Fc表示形成稳定的单层。很容易检测到10μg/ml HA250的结合。B类，（习惯用语）2-以10μg/ml孵育的Fc未与天然AnxA5结合，证实与AnxA5-Z的结合是特异性的。C类，HA250（10μg/ml）未与AnxA5-Z结合，表明与（HABD）结合2-Fc是特定的。为简单起见，中的分析不显示SLB形成B类和C类，仅显示频率偏移。
图3。
图3。
A类首先构建模型系统2，然后构建QCM-D。将50μg/ml SUV（由DOPC和双-NTA功能化脂质（9:1）制成）涂布到二氧化硅表面，形成SLB。最终绝对频率偏移，|Δ（f）|=29 Hz，略高于图2A类，很可能是因为存在更大的bis-NTA头组（33）。以10μg/ml孵育的His-HABD形成稳定的单层，很容易检测到10μg/ml HA250的结合。B类，HA250（10μg/ml）没有吸附到含有NTA功能的SLB上，his-HABD的结合单层可以在200 m米咪唑。Δ的变化（f）和ΔD类大约130分钟时，表面上没有任何变化，而是由于咪唑的存在导致周围溶液的粘度和/或密度发生变化。C类，His-HABD（10μg/ml）未与纯DOPC制成的SLB结合，因此缺乏NTA功能。
图4。
图4。
确认HA与CD44涂层双层的真实结合。BRIC-235 mAb阻断HA结合，随后是QCM-D(圈子, Δ（f）;正方形, ΔD类).A类，少量HA结合（Δ（f）=−2 Hz）保持在（HABD）上2-Fc与BRIC-235 mAb孵育60分钟。B类，在用20μg/ml BRIC-235 mAb孵育120分钟后，His-HABD覆盖的表面上的结合被完全消除。表面的制备分别如图2和图3所示。
图5。
图5。
椭圆偏振法监测模型系统形成期间磷脂、AnxA5-Z、CD44 HABDs和HA结合量。显示了两者的形成数据（HABD）2-Fc涂层（模型系统1，黑色方块)和His-HABD涂层（模型系统2，灰色圆圈)双层膜，由此估算HA结合的化学计量比（表2）。具体步骤如下：SLB形成(A类)，AnxA5-Z的顺序吸附(B类，仅型号系统1），HABD捕获(C类)和HA250绑定(D类). 每个孵育步骤从0分钟开始；采用图2和图3中的浓度；指示缓冲区中开始清洗(箭头在各自的面板).
图6。
图6。
HA大小对CD44结合程度和可逆性的影响。 A类，不同分子量HA与（HABD）结合的绝对量2-涂敷浓度为10μg/ml的Fc涂层SLB如下所示(阴影条)和后续冲洗(黑色填充条).误差线对应于通常两个单独测量之间的变化。B类，稳定结合HA的绝对量，来自A类，显示为分子量的函数。C类，由分子量为30、262、450、1156或2400 kDa的制剂形成的HA膜的表观厚度，由胶体探针RICM测定。显示的值表示添加（HABD）后测得的总膜厚的增加2-不同分子量的Fc和HA。
图7。
图7。
A类HA浓度对HA结合的影响。所示为262-kDa HA对被His-HABD致密涂层的SLB的吸附(蓝色圆圈)和（HABD）2-Fc公司(黑色三角形)作为HA浓度的函数。B类受体表面密度对HA结合的影响。将10μg/ml 262-kDa HA暴露于涂有His-HABD的SLB中(蓝色圆圈)和（HABD）2-Fc公司(黑色三角形)在不同的表面密度下。受体表面密度<1.5 pmol/cm的原点线性拟合2也显示了(橙色实线). 吸附量由QCM-D测定；借助于从QCM-D/椭偏仪联合测量中获得的校准曲线，将频率偏移转换为吸附质量或摩尔表面密度(补充图S1).误差线对应于实验噪声和由频率偏移计算质量或表面密度的不确定性。
图8。
图8。
柔性聚合物（如HA）吸附到平面粘合剂表面的理论性质。 A类，聚合物膜形态的示意图。聚合物的某些部分附着在表面，而其他部分则以柔性环和尾巴的形式在溶液中悬垂。薄膜厚度与聚合物的回转半径相似，R（右）克.B类聚合物浓度，c（c），在表面最高，并随着距离的增加而减小，z（z）de Gennes（49）的一个简单理论模型预测了幂律依赖性(实心黑线). 为了简单起见，我们使用了线性相关性(橙色虚线)估计表面近端区域的聚合物数量(下面的橙色区域这个线).
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