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.2010年7月8日；5（7）：e11472。
doi:10.1371/journal.pone.0011472。

酵母NDI1基因在大鼠动物模型中成功改善线粒体视神经病变

马修·马雷拉 1, Byoung Boo Seo先生, Biju B Thomas公司, Akemi Matsuno八木, 高雄八木
附属公司

酵母NDI1基因在大鼠动物模型中成功改善线粒体视神经病变

马修·马雷拉等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

背景：Leber遗传性视神经病变（LHON）是一种母系遗传性疾病，线粒体DNA点突变导致年轻人视力下降。迄今为止报告的大多数突变位于线粒体NADH-醌氧化还原酶复合物I亚单位编码基因内。建立LHON动物模型有助于阐明疾病的机制，并可用于可能的治疗策略开发。

方法/主要发现：我们建立了一个大鼠模型，将鱼藤酮微球注射到大鼠上丘的视层。这些动物表现出LHON最常见的特征。服用鱼藤酮后2周内观察到视力下降，对视网膜神经节细胞无明显影响。视网膜神经节细胞死亡发生在后期。使用我们的大鼠模型，我们研究了酵母替代NADH脱氢酶Ndi1的作用。通过将Ndi1基因导入上丘的光学层，我们能够在视网膜神经节细胞和轴突的所有区域的线粒体中高效表达Ndi1蛋白。值得注意的是，即使在大鼠的视力严重受损后，对带有NDI1基因的动物进行治疗，也能将视力完全恢复到正常水平。接受空载体或GFP基因的对照组没有效果。

结论/意义：本研究报告了大鼠LHON样症状的成功表现，并证明了NDI1基因治疗线粒体视神经病变的潜力。我们的结果表明，在疾病症状出现后，基因治疗有机会成功应用。

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数字

图1
图1。鱼藤酮暴露后大鼠视网膜的代表性图像和rAAV5-NDI1的影响。
将装有鱼藤酮的微球注射到大鼠脑SC中。两个月后，用苏木精-伊红染色检查视网膜是否受损。A、 视网膜的代表性图像；B、 视网膜细胞层厚度的比较。直方图显示苏木精-伊红染色后视网膜细胞层的平均厚度（大鼠n=4，每个大鼠视网膜的视网膜切片n=16）。对于图1A和1B，a为对照；b、 仅注射rAAV5-NDI1；c、 仅注射鱼藤酮微球；d、 给药后立即注射rAAV5-NDI1；e、 鱼藤酮微球给药1周后注射rAAV5-NDI1；f、 给药2周后注射rAAV5-NDI1鱼藤酮微球；g、 鱼藤酮微球给药后立即注射rAAV5-GFP；h、 鱼藤酮微球给药后立即注射rAAV5空载体；i、 鱼藤酮微球暴露2周后注射rAAV5-GFP；j、 给药鱼藤酮微球2周后注射rAAV5空载体。GCL，神经节细胞层；IPL，内丛状层；INL，内核层；OPL，外丛状层；ONL，外核层*p<0.05，**p<0.01，学生T检验与相同视网膜层对照组相比（a）。
图2
图2。显示髓鞘形成状态的视神经电子显微照片。
如图1所示，向大鼠注射鱼藤酮微球或rAAV5-NDI1或两者。注射鱼藤酮1个月后检查视神经。A： 控制（无注射）。B： rAAV5-NDI1-注入。C： 注射鱼藤酮微球。箭头表示部分髓鞘变性。D： 同时注射rAAV5-NDI1处理鱼藤酮微球。
图3
图3。Ndi1蛋白在整个视神经系统中的表达。
大鼠在SC中接受rAAV5-NDI1。注射两个月后，从卡通（A-E）中描述的位置收集组织，并对NDI1蛋白进行免疫组织化学染色（绿色）。DAPI（蓝色）显示细胞核。A1：上丘（SC）光学层（OL）冠状面。比例尺=150µm。A2：SC的光学层。比例尺=40µm。B： 视交叉的矢状截面。比例尺=100µm。C： 视神经的矢状切面。比例尺=100µm。D： 视神经进入视网膜的入口。比例尺=40µm。E1：视网膜的横切面。比例尺=40µm。E2：视网膜神经节细胞层的高倍图像，比例尺=10µm。
图4
图4。鱼藤酮治疗大鼠视神经髓鞘的丢失及其rAAV5-NDI1的保护作用。
用鱼藤酮治疗8周的大鼠获得视神经矢状面切片，并用特异性抗体对其进行髓鞘碱性蛋白（MBP）染色。A： MBP染色强度的代表性图片。比例尺=100µm。B： 直方图比较MBP染色的荧光强度。用ImageJ（NIH）评估MBP染色强度，每只动物测量8次，每组测量4次**p<0.01，n.s.（无显著性）学生T检验。误差条代表平均值±SD。对于A和B:A，控制；b、 鱼藤酮治疗大鼠8周；c、 rAAV5-NDI1在鱼藤酮微球后立即注射。
图5
图5。鱼藤酮治疗的大鼠的视动学测试显示出失明以及Ndi1的保护和改善作用。
如图1所示，在SC中向大鼠注射鱼藤酮微球。在治疗期间，每周进行视动学测试。对每只大鼠进行2分钟的监测，计算头部追踪反应的时间以计算视动评分。A： 不同治疗组大鼠视动学评分的时间依赖性变化。B： 第8周时所有大鼠组的光动力学评分的比较。各组大鼠的治疗方法如下：a、对照组（不注射）；b、 对照组（第0周注射rAAV5-GFP）；c、 第0周注射rAAV5-NDI1；d、 0周注射鱼藤酮；e、 第0周注射鱼藤酮，第2天注射rAAV5-NDI1；f、 第0周注射鱼藤酮，第1周注射rAAV5-NDI1；g、 第0周注射鱼藤酮，第2周注射rAAV5-NDI1；h、 第0周注射鱼藤酮，第2天注射rAAV5-GFP；i、 第0周注射鱼藤酮，第2天注射rAAV5空载体；j、 第0周注射鱼藤酮，第2周注射rAAV5-GFP；k、 第0周注射鱼藤酮，第2周注射rAAV5空载体*p＜0.05，ANOVA检验不包括鱼藤酮治疗组。
图6
图6。鱼藤酮治疗导致神经元和视网膜神经节细胞丢失。
大鼠接受鱼藤酮暴露2个月，如图1图例所示。A和B：SC光学层的组织切片分别用靶向神经元（NeuN）和星形胶质细胞（GFAP）的特异性抗体染色。C： 苏木精-伊红染色后，对GCL的视网膜神经节细胞进行计数。在至少间隔100µm的64个不同截面的每个视野中对细胞进行计数*p<0.05，**p<0.001，单向方差分析测试。误差条表示平均值±SD。
图7
图7。Ndi1表达对鱼藤酮处理细胞凋亡的预防作用。
如图1图例所示，将大鼠暴露于鱼藤酮2个月，并对视网膜样品进行单链DNA（红色）和DAPI（蓝色）染色。A： （A）对照组（不注射），（b）rAAV5-NDI1注射动物，（c）鱼藤酮微球注射动物。箭头突出显示了一些携带凋亡标记的细胞。视网膜视锥和视杆层中的明亮荧光是无特异性的，不考虑用于ssDNA评估。B： ssDNA染色阳性的视网膜神经节细胞数量以直方图表示。对每个视野中至少间隔100µm的不同部分的细胞进行计数**p<0.0001，方差分析。误差条表示平均值±SD。
图8
图8。Ndi1对RGC-5细胞中复合物I抑制的补偿作用。
A和B，细胞ATP水平。在6孔板中培养有或没有表达Ndi1或GFP的RGC-5细胞，并用100 nM鱼藤酮（A）或1µM FCCP（B）培养指定时间。使用荧光素酶分析系统评估细胞的ATP含量。误差条表示平均值±SD。C、 RGC-5细胞与100 nM鱼藤酮孵育8小时后的MitoSox染色。RGC-5细胞在不存在（a）或存在（b）复合物I抑制剂的情况下培养。表达Ndi1的RGC-5细胞在无鱼藤酮（c）或有鱼藤酮的情况下培养。D、 显示RGC-5细胞呼吸活性的氧合图。通过洋地黄素处理使细胞渗透。测量值为1×107每个分析的细胞数。呼吸底物和抑制剂按材料和方法中给出的浓度依次添加。耗氧率以µM O表示2/最小值。
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