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.2010年7月13日；18(1):23-38.
doi:10.1016/j.ccr.2010.05.024。

HIF和FoxA2的Siah2依赖性协同活性调节神经内分泌表型和神经内分泌前列腺肿瘤的形成

齐剑飞 1, 中山浩, 罗伯特·卡迪夫, 亚历山大·德·博罗夫斯基, 卡伦·考尔, 罗伊·威廉姆斯, 斯坦·克拉耶夫斯基, 丹·默科拉, 菲利普·卡彭特, 大卫·鲍特尔, 泽耶夫·A·罗奈
附属公司

HIF和FoxA2的Siah2依赖性协同活性调节神经内分泌表型和神经内分泌前列腺肿瘤的形成

齐剑飞等。 癌细胞. .

摘要

30%以上的前列腺腺癌（PCa）和NE前列腺肿瘤中的神经内分泌（NE）表型与侵袭性前列腺癌有关。TRAMP小鼠模型中NE前列腺肿瘤的形成在缺乏泛素连接酶Siah2的小鼠中受到抑制，该酶调节HIF-1α的可用性。HIF-1α和FoxA2（NE组织中表达的一种转录因子）之间的合作促进了p300的募集，以反式选择HIF-调节基因Hes6、Sox9和Jmjd1a。这些HIF-调节基因在转移性PCa中高度表达，是低氧介导NE表型、PCa转移和NE肿瘤形成所必需的。FoxA2的组织特异性表达结合Siah2依赖性HIF-1α的可用性，可以实现前列腺癌中NE前列腺肿瘤发展和NE表型所需的转录程序。

PubMed免责声明

数字

图1
图1。肿瘤发生拦污栅Tg（千克）/西亚2老鼠
A.原发肿瘤发病率拦污栅显示Siah2基因型小鼠的百分比。B.神经内分泌癌（NE）的典型H&E染色陷阱/Siah2+/−和AH源自陷阱/Siah2−/−老鼠。C.年NE和AH的发病率拦污栅有指示的小鼠西亚基因型。显示了每个基因型的小鼠数量。深色条表示NE+AH。对照组和对照组之间NE肿瘤发病率p<0.005西亚-有缺陷的拦污栅老鼠。D.使用指定抗体对具有指定基因型的原发性NE癌进行IHC分析。箭头表示正常前列腺上皮组织。5个月大NE肿瘤病灶的E.NSE和FoxA2染色拦污栅老鼠。F.指示基因型小鼠NE癌CD31的IHC染色。G.HIF-1α在PHYL表达的TRAMP-C细胞中的再表达。用指定的表达载体稳定转染细胞。进一步用HIF-1α稳定转染PHYL表达细胞，并在常氧（N）或缺氧（H）条件下维持6 H，然后进行HIF-1 a的western blot分析。H.和I.TRAMP-C细胞（3×106)将表达对照pKH3载体的PHYL或PHYL+HIF-1α皮下注射到裸鼠两侧。显示注射后8周肿瘤形成的频率（H）和异种移植瘤的大小（I）。在面板I中，每列代表5只小鼠的平均值±SD（标准偏差），pKH3的p<0.05与。PHYL+HIF-1α。参见图S1和表S1。
图2
图2。转移拦污栅Tg（千克）/Siah2小鼠
A.来自以下组织的指示组织的H&E染色拦污栅指示Siah2基因型的小鼠。转移性病变用箭头表示。B.NE标志物在肿瘤转移灶中的表达陷阱/Siah2+/−通过IHC染色显示抗体的小鼠。C.转移率拦污栅有指示的小鼠西亚基因型。检查的小鼠和组织数量：N=32（S2+/+和S2+/−)，16（S2−/−)，或9（S1a+/−：S2−/−)对于肝脏和肺部，N=26（S2+/+和S2+/−)，11（S2−/−)，或6（S1a+/−：S2+/−)用于淋巴结。对每个病例，用H&E染色检查5个肺或肝连续切片。D.肺切片的TUNEL染色（箭头所示的深棕色信号）陷阱/Siah2+/−和陷阱/Siah2−/−老鼠。大肠杆菌IHC染色法检测来自陷阱/Siah2+/−和陷阱/Siah2−/−老鼠。
图3
图3。FoxA2增强HIF转录活性
A.用HRE-Luc构建物和所示质粒转染TRAMP-C细胞。转染后24h，细胞在1%氧气中保存10h，收集细胞裂解物测定荧光素酶活性。β-Gal质粒用于正常化转染效率。N和H分别表示常氧和缺氧。p<0.01 pcDNA（N）与。HIF（牛），p<0.0005 HIF（牛）与。HIF+FoxA2（N）。首先用指示的siRNAs转染B.TRAMP-C细胞，然后用HRE-luc构建物转染48小时。第二次转染后24小时，在分析荧光素酶活性之前，将细胞在1%的氧气中维持10小时。对照组（H）p<0.005与。HIF-1α（H）、HIF-1β（H）或FoxA2（H）。用FOXA-Luc构建物转染C.TRAMP-C细胞，显示FoxA2缺失突变体。转染后24h，细胞用1%氧气处理10h，然后分析荧光素酶活性。p<0.01重量与。M-1，p>0.1重量与。M-2或M-3。D.用HRE-Luc构建物和所示质粒转染TRAMP-C细胞。转染后24h，细胞在1%氧气中保存10h，然后分析荧光素酶活性。p<0.001 HIF+WT（牛顿）与。HIF+m3（牛）。面板A-D中的每一列代表3个重复的平均值±SD。用所示质粒转染E.293T细胞。转染48小时后用Flag抗体结合珠（M2）沉淀HIF-1α，并用免疫印迹分析沉淀蛋白。F.TRAMP-C细胞维持在1%O25h后沉淀内源性HIF-1α，并通过免疫印迹分析共沉淀蛋白。将HIF-1αsiRNA转染G。TRAMP-C细胞48 h，然后在缺氧中维持5 h。沉淀内源性HIF-1β，并通过免疫印迹分析共沉淀蛋白。HIF-1α及其截短突变体在体外翻译，标记为35S、 并用涂有His-FoxA2的镍珠培养。洗涤3次后，用SDS-PAGE分离珠上的蛋白质并转移到硝化纤维膜上。35S标记的HIF-1α用荧光成像仪检测，然后用His抗体免疫印迹检测His-FoxA2。4%的体外翻译35S-HIF-1α作为输入。I.在体外翻译Flag-HIF-1α并结合到M2珠上，然后用35S标记的体外翻译FoxA2或其截断突变体。如图H.J.所示监测结合蛋白。TRAMP-C细胞用指示的载体稳定转染，然后在1%O中生长2HIF-1α免疫沉淀前6小时。用western blot分析共沉淀蛋白。K.Flag-HIF-1α在体外翻译并结合到M2珠上，然后与35S标记的体外翻译FoxA2和HIF-1β。如面板H所示，对结合蛋白进行监测。另见图S2。
图4
图4。HIF靶基因的一个子集通过与FoxA2的合作进行调节
A.用FoxA2 siRNAs转染TRAMP-C细胞。转染后48小时，细胞在1%氧气中保存10小时，然后分离RNA，对所示转录物进行qRT-PCR分析。控制（H）与。FoxA2（H）：VEGFA和Glut-1的p＞0.1，所有其他的p＜0.005。B.TRAMP-C细胞转染有指示的siRNA。转染后48小时，将细胞在1%的氧气中维持10小时。分离RNA用于Hes6转录物的qRT-PCR分析。对照组（H）与HIF-1α（H）或FoxA2（H）之间p<0.05。用含有野生型或突变的−66 bp HRE的1.25 kb Hes6启动子-Luc构建物转染C.TRAMP-C细胞。转染后24小时，在分析荧光素酶活性之前，用DMOG处理细胞（1 mM，16小时）。WT Hes6−DMOG的p<0.005与。+DMOG，突变型Hes6−DMOG的p>0.1与。+DMOG。D.用指定的质粒转染TRAMP-C细胞。转染后24小时，在分析荧光素酶活性之前，用DMOG处理细胞（1 mM，16小时）。WT Hes6:p<0.01 pcDNA−DMGO与。pcDNA+DMOG，p<0.05 pcDNA+DMGO与。Foxa2+DMOG。用对照或FoxA2 siRNA转染E.TRAMP-C细胞。转染后48小时，细胞在1%氧气中生长5小时，然后使用指示的抗体对Hes6启动子的HRE区进行ChIP分析。PCR产物在2%琼脂糖凝胶电泳上进行分析。显示了具有代表性的三次重复实验的反向凝胶图像。F.用1%氧气处理FoxA2 shRNA-表达细胞6小时，并用p300抗体进行ChIP分析。免疫沉淀材料用于VEGFA、Jmjd1a和Hes6 HRE相关区域的QPCR分析。ChIP QPCR的结果被归一化为输入的结果。两种细胞系中，对照组和shFoxA2之间的所有基因均为p<0.01。用对照或p300 siRNA转染G细胞48小时，然后通过qRT-PCR分析所示转录物。TRAMP-C和Rv1:p>0.1控制与。VEGFA p300，所有其他p<0.05。用Hes6或VEGFA启动子-Luc载体HIF-1α联合转染H.TRAMP-C细胞，并增加p300的数量。转染后24小时，收集细胞裂解物进行荧光素酶分析。Hes6：p<0.001 0µg与。三者都有；VEGFA:p<0.005 0微克与。0.5微克，p>0.1微克与。其他两个。将Hes6启动子-Luc（H）或VEGFA启动子-Loc（I）与所示质粒一起转染I和J.TRAMP-C细胞。转染后24h，收集细胞裂解物，分析荧光素酶活性。在面板A-D、F-J中，每列代表3个实验的平均值±SD。Hes6:p<0.01高强度聚焦超声与。HIF+FoxA2、HIF与。HIF+p300和HIF+FoxA2与。HIF+FoxA2+p300；VEGFA：这些比较的p>0.1。K.Flag-p300在体外翻译并与M2珠结合。体外翻译HIF-1α或FoxA2，并用35S.等量35S-HIF-1α和35S-FoxA2与M2珠结Flag-p300孵育。结合蛋白的监测如图3H所示。L.Flag-p300（wt或ΔCH1）在体外翻译并与M2珠结合。体外翻译HIF-1α和FoxA2，并用35S.等量35S-HIF-1α和35S-FoxA2与M2珠结合Flag-p300或Flag-p300-ΔCH1混合并孵育。结合蛋白的监测如图3H所示。另请参见图S3、表S2、S3。
图5
图5。Hes6、Sox9和Jmjd1a是TRAMP细胞发生肿瘤所必需的
A.用指示的载体稳定转染TRAMP-C细胞。插图显示PHYL和NxN的western blot。然后用编码Hes6、Sox9或Jmjd1a的逆转录病毒构建物分别或全部感染PHYL表达细胞（HSJ）。1×105细胞在软琼脂上在1%氧气下生长3周。所示为6孔板每孔的菌落数。p=0.4（pBabe vs N×N），p=0.053（N×N与。PHYL+HSJ），p<0.0005（N×N与。PHYL、PHYL+Hes6、PHYL+Sox9或PHYL+Jmjd1a），p<0.05（PHYL+HSJ与。PHYL、PHYL+Hes6、PHYL+Sox9或PHYL+Jmjd1a）。用指示的shRNA转染B。TRAMP-C细胞。插图显示FoxA2的western blot。然后用Hes6、Sox9或Jmjd1a逆转录病毒构建物分别或全部感染shFoxA2-表达细胞（HSJ）。1×105细胞在软琼脂上在1%O的温度下生长2持续3周。所示为6孔板每孔的菌落数。在面板A和B中，每列代表3个重复的平均值±SD。p=0.06（pKLO.1 vs.shFoxA2+HSJ），p<0.005（pKLOC.1与。shFoxA2、shFoxA2+Hes6、shFoxA2+Sox9或shFoxA2+Jmjd1a），p<0.005（shFoxA1+HSJ与。shFoxA2、shFoxA2+Hes6、shFoxA2+Sox9或shFoxA2+Jmjd1a）。C、 D，E，F，例如1×106将图5A和5B中所述的TRAMP-C转染剂注射到裸鼠前列腺中。注射两个月后，对小鼠的泌尿生殖道进行解剖，并对前列腺肿瘤的形成进行定量。C组显示前列腺肿瘤的代表性图像，用箭头表示。图D和F描绘了肿瘤形成的频率。面板E和G显示了所形成肿瘤的平均大小。在面板E和F中，每列代表5只小鼠的平均值±SD。p<0.05 pBabe与。PHYL+HSJ和NxN与。PHYL+HSJ，p<0.001（pKLO.1与。shFoxA2、shFoxA2+Hes6或shFoxA2+Jmjd1a），p<0.005（shFoxA1+HSJ与。shFoxA2、shFoxA2+Hes6或shFoxA2+Jmjd1a），p<0.01（pKLO.1与。shFoxA2+Sox9），p=0.2（pKLO.1与。shFoxA2+HSJ）。另请参见图S4。
图6
图6。人前列腺癌细胞低氧诱导的NE表型
在对NSE和ChgB进行qRT-PCR分析之前，将CWR22Rv1细胞在常氧或缺氧（1%O2）条件下培养指定时间。低氧条件下的转录水平与常压条件下的一致。NSE缺氧p<0.05，p<0.005，p<00001与。分别在第1天、第3天和第5天正常氧。ChgB缺氧p=0.19，p<0.005，p<00001与。分别在第1天、第3天和第5天正常氧。B.Rv1细胞在1%氧气下生长指定时间。总裂解产物用于NSE和ChgB的western blot分析。免疫沉淀Hes6和Sox9，然后进行western blot分析。将C.Rv1细胞以低密度接种到组织培养板上，并在1%氧气中培养6天。对细胞进行固定并对NSE或ChgB进行免疫染色。注意低氧培养的细胞中有神经突样突起。在qRT-PCR分析之前，将D.Rv1细胞在缺氧条件下培养指定时间。低氧条件下的转录水平被归一化为相应常压样本的转录水平。在所有三个时间点，所有三份成绩单的P<0.005。用对照pBabe载体或PHYL稳定转染E.Rv1细胞。插图：western blot显示PHYL的表达。表达PHYL的Rv1细胞进一步被Hes6、Sox9或Jmjd1a病毒构建物单独或联合感染（HSJ）。在对NSE进行qRT-PCR分析之前，细胞在1%氧气下培养5天。p<0.01 pBabe与。PHYL+HSJ，P<0.0001 pBabe与。所有其他，p<0.005 PHYL+HSJ与。其他表达PHYL的细胞。用对照pKLO.1载体或FoxA2 shRNA转染F.Rv1细胞。插图：western blot显示FoxA2被击倒。用Hes6、Sox9或Jmjd1a的病毒构建体单独或组合（HSJ）进一步感染shFoxA2表达细胞。在对NSE进行qRT-PCR分析之前，细胞在1%氧气下培养5天。p<0.05 pKLO.1与。shFoxA2+HSJ，p<0.0001 pKLO.1与。所有其他，p<0.001 shFoxA2+HSJ与。其他shFoxA2-表达细胞。将G.Rv1转染体接种在低密度的组织培养板上，并在1%氧气下维持6天。用相控显微镜观察细胞形态。在三份6孔板上对具有神经样结构的菌落数量进行了评分（标准：菌落外围>1/3的细胞具有长度超过20µm的神经样结构）。p<0.01 pBabe与。PHYL或PHYL+HSJ，p<0.001 PHYL+HSJ与。PHYL，p<0.05 pKLO.1与。shFoxA2或shFoxA2+HSJ，p<0.005 shFoxA1与。shFoxA2+HSJ。在面板A、D、E、F、G中，每列代表3个重复的平均值±SD。高1×106将E和F中描述的Rv1转染体注射到裸鼠前列腺中。注射4周后，收集原位肿瘤并测量其大小。p<0.05 pBabe与。PHYL或PHYL+HSJ，p>0.1 PHYL与。PHYL+HSJ和pKLO.1与。shFoxA2或shFoxA2+HSJ。I.献血前从H中描述的小鼠心脏采集血液，在选择培养基中培养2周。对平板上的菌落数进行评分，并将其归一化为血容量。p<0.01 pBabe与。PHYL或PHYL+HSJ，p<0.001 PHYL与。PHYL+HSJ，p<0.05 pKLO.1与。shFoxA2或shFoxA2+HSJ，p<0.005 shFoxA1与。shFoxA2+HSJ。在面板H和I中，每列代表5只小鼠的平均值±SD。J.从H中描述的小鼠收集淋巴结（LN），并用H&E染色以确定转移。p<0.05（pBabe与。PHYL），p=0.17（PHYL与。PHYL+HSJ），p<0.01（pKLO.l vs.shFoxA2），p<0.05（shFoxA2vs.shFoxA2+HSJ）。K、对H组所述的原位肿瘤切片进行NSE、HIF-1α和FoxA2的IHC染色。L.对Rv1原位模型的LN或肝转移进行NSE的IHC染色。另请参见图S5，表S4。
图7
图7。前列腺肿瘤中HIF/FoxA2靶点的变化
A.进行激光捕获显微切割，从肿瘤中收集NE癌细胞陷阱/Siah2+/−或陷阱/Siah2−/−老鼠。分离RNA，对指示转录物进行qRT-PCR分析。每列代表2个重复的平均值±SD。西亚2+/− 与Siah2−/−Hes6、Sox9和Jmjd1a的p<0.05，VEGFA和Glut-1的p=0.78和0.46。B.对具有NED病灶的人前列腺癌进行FoxA2、Hes6和HIF-1α的IHC。所示为具有相应NE控制标记NSE的代表性图像。使用所示抗体对15例人PCa标本的连续切片进行了C.IHC染色，其中10例具有NE表型（NSE阳性），5例没有NE表型。Hes6、Sox9和Jmjd1a在有NE表型的人PCa中的共表达与无NE表型人PCa相比具有统计学意义（p<0.05）。D.对由PINs和不同Gleason评分的前列腺癌组成的人类前列腺TMA进行IHC染色，每个肿瘤组的数量如图所示。染色强度由2名病理学家根据4个等级进行评分：0（无染色）、1（弱染色）、2（中染色）和3（强染色）。刻度0和1定义为阴性染色，而刻度2和3定义为阳性染色。图中所示为阳性染色核心中所示抗体的百分比。E.所示为GSE3325基因表达的聚集模式。列表示肿瘤样本（良性，B1–B6；初级，P1–P7；转移，M1–M6），行表示基因。heatmap用红色表示较高的表达水平，用蓝色表示较低的表达水平。每个基因的表达数据进行行标准化。转移性PCa中Siah2、FoxA2、Hes6、Jmjd1a、Plod2、DDC、ChgB和ENO2的转录水平在统计学上显著高于原发性PCa。另请参见图S6。
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