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.2010年7月；120(7):2355-69.
doi:10.1172/JCI40671。 Epub 2010年6月23日。

二甲双胍通过降低肝脏能量状态抑制小鼠肝脏糖异生，独立于LKB1/AMPK途径

马克·福雷茨 1, 索菲·赫布拉德, 乔斯琳·勒克莱尔, Elham Zarrinpashneh公司, 莫德·索蒂, 吉尔斯·米提厄, Kei Sakamoto先生, 法布里奇奥·安德雷利, 贝诺伊特·维奥利特
附属公司

二甲双胍通过降低肝脏能量状态独立于LKB1/AMPK途径抑制小鼠的肝糖异生

马克·福雷茨等。 临床研究杂志. 2010年7月.

摘要

二甲双胍广泛用于治疗2型糖尿病患者的高血糖。最近有人提出LKB1/AMP活化蛋白激酶（LKB1/AMPK）途径来介导二甲双胍对肝脏糖异生的作用。然而，这一途径的分子机制仍然难以捉摸。令人惊讶的是，我们在这里发现，在肝脏中缺乏AMPK的小鼠中，血糖水平与野生型小鼠相当，二甲双胍的降糖作用保持不变。与野生型肝细胞相比，缺乏AMPK的肝细胞表现出正常的葡萄糖生成和糖异生基因表达。相反，LKB1缺乏的肝细胞中糖异生上调。二甲双胍降低了葡萄糖-6-磷酸酶催化亚单位（G6Pase）编码基因的表达，而在野生型、AMPK缺乏型和LKB1缺乏型肝细胞中，细胞溶质磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（Pepck）基因的表达不受影响。令人惊讶的是，与野生型肝细胞相比，在AMPK和LKB1缺陷的肝细胞中，二甲双胍诱导的葡萄糖生成抑制被放大。这种抑制作用与细胞内ATP含量的减少呈剂量依赖性相关，ATP含量对葡萄糖生成至关重要。此外，二甲双胍通过PPAR-γ辅激活物1alpha（PGC-1α）的过度表达，在糖异生基因的强制表达下，二甲双酮诱导的葡萄糖生成抑制被保留下来，这表明二甲双酮通过转录依赖性过程抑制糖异生。总之，我们证明二甲双胍通过降低肝脏能量状态以非依赖于LKB1和AMPK的方式抑制肝脏糖异生。

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数字

图1
图1。二甲双胍抑制AMPKα1α2-null（AMPK-KO）小鼠肝细胞的糖异生。
附着后，将WT和AMPK缺陷的原代肝细胞在含有100 nM dex的M199培养基中培养16小时。然后在含有乳酸/丙酮酸（10:1 mM）和100 nM-dex的无葡萄糖DMEM中单独培养肝细胞，或与100μM Bt一起培养肝细胞2-cAMP和添加或不添加0.25、0.5、1或2 mM二甲双胍。8小时后，收集培养基进行葡萄糖测量，并采集细胞进行Western blot和糖异生基因表达分析。(一)葡萄糖生成量被标准化为蛋白质含量，并表示为在没有Bt的情况下培养的WT肝细胞产生的葡萄糖的百分比2-cAMP和二甲双胍。结果代表了5个独立实验。(B类)对磷酸-AMPKα（Thr172）、AMPKα、磷酸-ACC（Ser79）、ACC、CRTC2、G6Pase和PEPCK进行免疫印迹。印迹是至少5个独立实验的代表。(C类)相对mRNA水平第1页α,佩普克、和G6酶表达为相对于在没有Bt的情况下培养的WT肝细胞水平的折叠激活2-cAMP和二甲双胍。结果代表了5个独立实验。数据为平均值±SEM。§P（P）< 0.001,‡P（P）与未经Bt培养的WT和AMPK-KO肝细胞相比<0.0012-cAMP*P（P）< 0.001,†P（P）与Bt孵育的WT和AMPK-KO肝细胞相比，<0.0012-仅cAMP；#P（P）与相同条件下培养的WT肝细胞相比，<0.01。
图2
图2。二甲双胍对AMPKα1α2血糖水平的影响LS（负载感应）–/–老鼠。
(一)24小时禁食对照和AMPKα1α2肝脏中AMPKα和PEPCK蛋白的蛋白质印迹分析LS（负载感应）–/–老鼠。β-肌动蛋白免疫印迹作为负荷对照。每个通道代表一只老鼠的肝脏样本。(B类)在禁食和喂食对照组和AMPKα1α2组中测量血糖水平LS（负载感应）–/–老鼠。n个= 5–6. (C类)在禁食和喂食对照组和AMPKα1α2组中测量血浆胰岛素水平LS（负载感应）–/–老鼠。数据为平均值±SEM(n个= 5–6). (D类)对照组和AMPKα1α2的丙酮酸耐受性试验（2 g/kg）LS（负载感应）–/–用小鼠评估肝脏糖异生。n个= 6–7. (E类)对照组和AMPKα1α2的胰岛素耐受性试验（0.25 U/kg）LS（负载感应）–/–老鼠。n个= 6–9. 对照组二甲双胍耐受性试验(F类)和AMPKα1α2LS（负载感应）–/–(G公司)老鼠。小鼠经口灌胃给予50、150或300 mg/kg二甲双胍或媒剂，30分钟后口服葡萄糖（3 g/kg体重）。n个= 6–10. 数据为平均值±SEM*P（P）< 0.05, **P（P）与溶媒对照组相比，二甲双胍<0.005，150 mg/kg；#P（P）< 0.01,##P（P）与对照组相比，<0.001300 mg/kg。
图3
图3。AICAR对WT和AMPK-KO肝细胞糖异生的影响。
附着后，将WT和AMPK缺陷的原代肝细胞在含有100 nM dex的M199培养基中培养16小时。然后在含有乳酸/丙酮酸（10:1 mM）和100 nM dex的无葡萄糖DMEM中单独或与100μM Bt孵育肝细胞2-cAMP和带有或不带有125、250或500μM AICAR。8小时后，收集培养基进行葡萄糖测量，并采集细胞进行Western blot和糖异生基因表达分析。(一)葡萄糖生成量被标准化为蛋白质含量，并表示为在没有Bt的情况下培养的WT肝细胞葡萄糖生成量的百分比2-cAMP和AICAR。结果代表了5个独立实验。(B类)对磷酸-AMPKα（Thr172）、AMPKα、磷酸-ACC（Ser79）、ACC、CRTC2和PEPCK进行免疫印迹。印迹代表了至少3个独立的实验。(C类)相对mRNA水平第1页α,佩普克、和G6酶表达为在没有Bt的情况下培养的WT肝细胞的百分比2-cAMP和AICAR。结果代表了5个独立实验。数据为平均值±SEM。§P（P）< 0.01,‡P（P）与未经Bt培养的WT和AMPK-KO肝细胞相比<0.012-cAMP*P（P）< 0.01,†P（P）与Bt孵育的WT和AMPK-KO肝细胞相比<0.012-仅cAMP。
图4
图4。A-769662对WT和AMPK-KO肝细胞糖异生的影响。
附着后，将WT和AMPK缺陷的原代肝细胞在含有100 nM dex的M199培养基中培养16小时。然后在含有乳酸/丙酮酸（10:1 mM）和100 nM-dex的无葡萄糖DMEM中单独培养肝细胞，或与100μM Bt一起培养肝细胞2-cAMP和带有或不带有1、10或100μM A-769662。8小时后，收集培养基进行葡萄糖测量，并采集细胞进行Western blot和糖异生基因表达分析。(一)葡萄糖生成量被标准化为蛋白质含量，并表示为在没有Bt的情况下培养的WT肝细胞葡萄糖生成量的百分比2-cAMP和A-769662。结果代表了5个独立实验。(B类)对磷酸-AMPKα（Thr172）、AMPKα、磷酸-ACC（Ser79）、ACC、CRTC2和PEPCK进行免疫印迹。印迹是至少5个独立实验的代表。(C类)相对mRNA水平第1页α,佩普克、和G6酶表达为相对于在没有Bt的情况下培养的WT肝细胞水平的折叠激活2-cAMP和A-769662。结果代表了5个独立实验。数据为平均值±SEM。§P（P）< 0.01,‡P（P）与未经Bt培养的WT和AMPK-KO肝细胞相比<0.012-cAMP*P（P）< 0.01,†P（P）与Bt孵育的WT和AMPK-KO肝细胞相比<0.012-仅cAMP。
图5
图5。二甲双胍降低C57BL/6J小鼠原代肝细胞和肝脏的能量状态。
(一–E类)附着后，将C57BL/6J小鼠原代肝细胞在含有100 nM dex的M199培养基中培养16小时。然后在含有乳酸/丙酮酸（10:1 mM）和100 nM-dex的无葡萄糖DMEM中单独培养肝细胞，或与100μM Bt一起培养肝细胞2-cAMP和添加或不添加0.25、0.5、1或2 mM二甲双胍。8小时后，收集培养基用于葡萄糖测量，并收获细胞用于腺嘌呤核苷酸含量的测量。(一)肝细胞中ATP、ADP和AMP含量(B类)AMP/ATP比率，以及(C类)每种情况下的腺嘌呤核苷酸总含量都会显示出来。(D类)葡萄糖生成量被标准化为蛋白质含量，并表示为在没有Bt的情况下培养的肝细胞产生的葡萄糖的百分比2-cAMP和二甲双胍。(E类)葡萄糖生成量和ATP含量之间的相关性如所示D类和一分别是。结果代表了3个独立实验*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01,§P（P）< 0.005,§§P（P）<0.001，与在没有Bt的情况下培养的肝细胞相比2-cAMP和二甲双胍；†P（P）< 0.05,††P（P）< 0.01,#P（P）< 0.005,##P（P）与Bt孵育的肝细胞相比<0.0012-仅cAMP。(F类和G公司)10周龄C57BL/6J雄性小鼠(n个=7/组）连续5天口服20或50 mg/kg二甲双胍水溶液或单独用水。第五天，小鼠禁食24小时，并在二甲双胍给药1小时后收集肝脏，以测定肝脏ATP、ADP和AMP。(F类)腺嘌呤核苷酸总含量和(G公司)显示了每种情况下的AMP/ATP比率*P（P）< 0.05, **P（P）与车辆相比<0.005。数据为平均值±SEM。
图6
图6。AMPK激活剂对WT和AMPK-KO肝细胞内ATP含量的影响。
附着后，将WT和AMPK缺陷的原代肝细胞在含有100 nM dex的M199培养基中培养16小时。然后在含有乳酸/丙酮酸（10:1 mM）和100 nM-dex的无葡萄糖DMEM中单独培养肝细胞，或与100μM Bt一起培养肝细胞2-cAMP和添加或不添加不同浓度的二甲双胍、AICAR或A-769662。8小时后，收集细胞进行ATP含量测量。结果代表了6个独立实验。数据为平均值±SEM。§P（P）< 0.001,‡P（P）与未经Bt培养的WT和AMPK-KO肝细胞相比<0.0012-cAMP*P（P）< 0.05, **P（P）与Bt孵育的野生型肝细胞相比，<0.0012-仅cAMP；†P（P）< 0.01,††P（P）与Bt孵育的AMPK-KO肝细胞相比<0.0012-仅cAMP；#P（P）与相同条件下培养的WT肝细胞相比，<0.01。
图7
图7。二甲双胍对WT和WT中AMPK激活的影响磅1-KO肝细胞。
附着后，将WT和LKB1缺陷的原代肝细胞在含有100 nM dex的M199培养基中培养16小时。然后在含有乳酸/丙酮酸（10:1 mM）和100 nM-dex的无葡萄糖DMEM中单独培养肝细胞，或与100μM Bt一起培养肝细胞2-cAMP和添加或不添加0.25、0.5、1或2 mM二甲双胍。8小时后，收集细胞进行Western blot分析并测量LKB1活性。(一)用抗LKB1抗体进行免疫印迹分析，评估LKB1蛋白水平。β-肌动蛋白作为负载对照进行免疫印迹。(B类)LKB1活性在免疫沉淀后进行评估，并用LKB肽肽进行测定。对来自3个独立实验的肝细胞提取物进行检测。(C类)对磷酸-AMPKα（Thr172）、AMPKα、磷酸-ACC（Ser79）、ACC、CRTC2、G6Pase和PEPCK进行免疫印迹。印迹是3个独立实验的代表。
图8
图8。二甲双胍抑制LKB1缺陷小鼠肝细胞的糖异生。
附着后，将WT和LKB1缺陷的原代肝细胞在含有100 nM dex的M199培养基中培养16小时。然后在含有乳酸/丙酮酸（10:1 mM）和100 nM-dex的无葡萄糖DMEM中单独培养肝细胞，或与100μM Bt一起培养肝细胞2-cAMP和添加或不添加0.25、0.5、1或2 mM二甲双胍。8小时后，收集培养基进行葡萄糖测量，并采集细胞进行ATP含量评估和糖异生基因表达分析。(一)葡萄糖生成量被标准化为蛋白质含量，并表示为在没有Bt的情况下培养的WT肝细胞产生的葡萄糖的百分比2-cAMP和二甲双胍。结果代表了3个独立实验。(B类)相对mRNA水平第1页α,佩普克、和G6酶表达为相对于在没有Bt的情况下培养的WT肝细胞水平的折叠激活2-cAMP和二甲双胍。3个独立实验的结果具有代表性。(C类)ATP细胞内含量标准化为蛋白质含量，并表示为在没有Bt的情况下孵育的WT肝细胞ATP含量的百分比2-cAMP和二甲双胍。结果代表了4个独立实验。数据为平均值±SEM。§P（P）< 0.01,‡P（P）与未经Bt培养的WT和AMPK-KO肝细胞相比<0.012-cAMP*P（P）< 0.01,†P（P）与WT和磅1-Bt孵育KO肝细胞2-仅cAMP；#P（P）与相同条件下培养的WT肝细胞相比，<0.05。
图9
图9。强制表达糖异生基因并不能阻止二甲双胍诱导的肝葡萄糖生成抑制。
附着后，将WT原代肝细胞感染25 PFU/细胞的Ad-GFP或Ad–PGC-1α腺病毒，并在含有100 nM dex的M199培养基中培养16小时。然后将肝细胞培养在含有乳酸/丙酮酸（10:1 mM）和100 nM dex的无葡萄糖DMEM中，或与0.25、0.5或1 mM二甲双胍一起培养。8小时后，收集培养基用于葡萄糖测量，并收获细胞用于蛋白质印迹和糖异生基因表达分析以及ATP含量测定。(一)相对mRNA水平第1页α,佩普克、和G6酶表达为相对于Ad-GFP感染肝细胞水平的折叠激活。结果代表3个独立的实验。§P（P）与Ad-GFP感染的肝细胞相比<0.001。(B类)对PEPCK、G6Pase、磷酸-AMPKα（Thr172）、AMPKα、磷酸-ACC（Ser79）和ACC进行免疫印迹。印迹代表3个独立实验。(C类)葡萄糖生产和(D类)ATP细胞内含量归一化为蛋白质含量，并表示为不含二甲双胍培养的Ad-GFP或Ad-PGC-1α感染肝细胞产生的ATP的百分比。结果代表5个独立实验。§P（P）与Ad-GFP感染的肝细胞相比<0.01；#P（P）< 0.05, *P（P）< 0.01, **P（P）与不含二甲双胍培养的Ad–PGC-1α感染肝细胞相比，<0.001。数据为平均值±SEM。
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中的注释

  • 二甲双胍AMPK-非依赖性效应的生动故事。
    Miller RA、Birnbaum MJ。 Miller RA等人。 临床投资杂志。2010年7月；120(7):2267-70. doi:10.1172/JCI43661。Epub 2010年6月23日。 临床投资杂志。2010 PMID：20577046 免费PMC文章。 审查。

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