Epithelial-to-mesenchymal transition of murine liver tumor cells promotes invasion

doi:10.1002/hep.23748

.2010年9月；52(3):945-53.

doi:10.1002/hep.23748。

小鼠肝癌细胞的上皮-间充质转化促进侵袭

魏丁¹, 汉宁·你, Hien Dang先生, 弗朗西斯·勒布朗, 维维安·加利西亚, 雪莉·C·路, Bangyan Stiles公司, C巴特·朗特里

附属公司

PMID： 20564331
预防性维修识别码：项目经理3032356
内政部： 10.1002/庚23748

小鼠肝癌细胞的上皮-间充质转化促进侵袭

魏丁等。肝病学. 2010年9月.

.2010年9月；52(3):945-53.

doi:10.1002/hep.23748。

作者

魏丁¹, 汉宁·你, Hien Dang先生, 弗朗西斯·勒布朗, 维维安·加利西亚, 雪莉·C·路, Bangyan Stiles公司, C巴特·朗特里

附属

¹宾夕法尼亚州立大学医学院儿科和药理学系，美国宾夕法尼亚州赫尔希市，邮编17033。

PMID： 20564331
预防性维修识别码：项目经理3032356
内政部： 10.1002/庚23748

摘要

上皮-间充质转化（EMT）预计在肝细胞癌的转移性疾病中起关键作用。在本研究中，我们使用一种新型EMT小鼠模型来阐明肿瘤进展和转移的机制。从Pten（loxp/loxp）/Alb-Cre（+）小鼠分离的总共2 x 10（6）个肝细胞，从单个CD133（+）CD45（-）细胞克隆扩增而来，第0代（P0），依次移植以获得两代肿瘤细胞P1和P2。使用微阵列和实时聚合酶链反应分析细胞的基因表达。功能分析包括体外细胞增殖、迁移和侵袭以及体内原位肿瘤转移检测。虽然P0、P1和P2均形成与混合肝上皮一致的肿瘤，但在P2细胞内，可以清楚地看到两种不同的细胞类型：上皮形态类似于P0细胞的细胞和纤维母细胞形态的细胞。这些P2间充质细胞在伤口愈合中表现出增加的运动；Matrigel基底膜细胞侵袭增加；蜗牛1、Zeb1和Zeb2的EMT相关基因表达增加；与P2上皮细胞相比，P2间充质细胞在体内的肿瘤生长速度显著加快，并侵犯肠、胰腺、脾脏和淋巴结。此外，P2间充质细胞分泌高水平的肝细胞生长因子（HGF），我们建议其以旁分泌方式作用，以驱动上皮细胞进行EMT。此外，第二个甲硫氨酸腺苷转移酶1a缺乏的小鼠肝癌干细胞系在连续移植后获得EMT，这表明EMT并不局限于Pten-deleted肿瘤。

结论：EMT与体内肝肿瘤的高增殖、侵袭和转移率有关，这是由间充质肿瘤细胞分泌的HGF在前馈机制中驱动的。

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潜在利益冲突：无需报告。

数字

图1
细胞衍生过程图。铂族^−/−肿瘤细胞在裸鼠皮下移植两轮后获得EMT。亲本细胞系P0显示上皮细胞形态。P2内观察到两种不同的细胞类型：上皮细胞和间充质细胞。上皮细胞呈鹅卵石状，细胞与细胞紧密接触，与P0细胞相似。间充质细胞具有细长的纺锤状形态。P2上皮（P2E）和间充质（P2M）表型细胞被亚分离。

图2
EMT微阵列数据集。（A）具有统计学意义的EMT相关基因的层次聚类进一步证实P2细胞获得EMT。几种上皮细胞标记物，如*克劳丁·E-cadherin 3*(*氯化物3*),*角蛋白质类*(*Krt8、Krt14、Krt18*、和*Krt19*)、和*Plakophilin 2型*(*Pkp2项目*)显著下调，而一些间充质细胞标记物，基质金属蛋白酶(*百万2/3*)和EMT相关转录因子(*蜗牛1，Zeb1*、和*Zeb2公司*)与P2E细胞相比，P2M细胞表达上调。将绘制原始强度值。单个样本t吨进行了测试，并且*P（P）*使用TIGR MultiExperiment Viewer（n=4个连续段落/组；完整数据集可在网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo，登录号GSE18255）。（B）使用实时逆转录PCR验证EMT标记显示*E-钙粘蛋白*显著下调EMT相关转录因子，*蜗牛1，Zeb1*、和*Zeb2公司*在P2M间充质细胞中显著上调（n=3，平均值±SD）**P（P）*< 0.05.

图3
P2肿瘤EMT的确认。（A） E-cadherin免疫荧光染色证实P2M细胞的间充质表型。（B）具有混合上皮和间充质形态的P2肿瘤的代表性苏木精-伊红染色和E-钙粘蛋白免疫组织化学染色。

图4
间充质细胞分泌HGF并诱导P2E细胞EMT。（A）半定量逆转录PCR检测到HGF在P2和P2M细胞中的高表达。（B）通过酶联免疫吸附试验检测HGF，将其分泌到P2M细胞的CM中（n=3，平均值±SD）**P（P）*与P2E相比<0.01。（C）重组HGF（5 ng/mL）促进P2E细胞接受EMT治疗，表现出形态学改变，（D）重组HGF促进E-cadherin的下调（n=3，平均值±SD）**P（P）*< 0.05. （E）当P2E细胞在SF培养24小时后用从P2M收集的CM处理时，立方和鹅卵石上皮细胞转变为纺锤状间充质细胞。（F）从P2M细胞中收集的CM诱导P2E细胞接受EMT，显示E-cadherin下调，而N-cadherin、Zeb1和Zeb2显著上调（N=3，平均值±SD）**P（P）*与SF对照组相比，<0.05。

图5
P2M细胞在体内表现出侵袭性生长。（A）容量分析显示P2和P2M细胞显著生长（n=4只小鼠/组，平均值±SD）**P（P）*<0.01与P0。（B）组织学检查表明，P1和P2E细胞发育成均匀的肝癌样肿瘤，而P2M细胞形成纤维母细胞瘤样肿瘤，P2细胞引发的肿瘤混合了上皮细胞和间充质细胞形态（苏木精-伊红染色）。

图6
间充质细胞在体外迁移和侵袭。（A）伤口愈合试验表明，与上皮细胞相比，有更多的间充质细胞迁移到伤口区域。（B） Matrigel分析显示大量P2M细胞通过孔隙侵入（n=3，平均细胞/场±SD）**P（P）*与P2E相比<0.01。

图7
间充质细胞在体内迁移并侵袭腹部器官。EMT的获得促进了分别用P0、P2E和P2M细胞原位移植的裸鼠的肿瘤侵袭。（A）生物发光图像显示P2M肿瘤细胞扩散至腹腔并侵犯多个器官，而P0和P2E肿瘤生长仅限于肝脏（n=5只小鼠/组，具有代表性的前后和侧面图像；暴露时间，P0和P2E为1分钟，P2M为5秒）。苏木精-伊红染色结果显示P2M衍生肿瘤肝内转移（B），胰腺腺泡组织（C）、结肠粘膜（D）、脾脏（E）、腹膜淋巴结（F）和前腹壁骨骼肌（G）浸润。

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