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.2010年2月；6(2):217-27.
doi:10.4161/auto.6.2.11014。 Epub 2010年2月22日。

VCP/p97对含泛素的自噬体的成熟至关重要，这种功能因引起IBMPFD的突变而受损

艾米莉·特雷斯 1, 弗洛里安·萨洛蒙斯, 朱妮·维萨, 劳拉·博特, 弗吉尼亚基莫尼斯, 左宗尧, 尼科·P·丹图马, J保罗·泰勒
附属公司

VCP/p97对含泛素的自噬体的成熟至关重要，这种功能因引起IBMPFD的突变而受损

艾米莉·特雷斯等。 自噬. 2010年2月.

摘要

VCP（VCP/p97）是AAA（+）-ATP酶家族伴侣样蛋白的一个广泛表达的成员，它调节着许多细胞过程，包括染色质去凝聚、同源膜融合和蛋白酶体对泛素依赖性蛋白的降解。VCP突变导致多系统退行性疾病，包括包涵体肌病、骨Paget病和额颞叶痴呆（IBMPFD）。这里我们表明VCP对自噬体成熟至关重要。我们生成了稳定表达双标记LC3（mCherry-EGFP-LC3）的细胞，可以监测自噬体成熟。我们确定，通过RNAi介导的显性阴性VCP的敲除或过度表达导致VCP缺乏，导致未成熟的自噬小泡大量积聚，其中一些小泡异常大，酸化，并表现组织蛋白酶B活性。此外，疾病相关VCP突变体（R155H和A232E）的表达也会导致这种自噬缺陷。在基础条件下和蛋白酶体抑制激发的细胞中，VCP对自噬体成熟至关重要，但在饥饿激发的细胞内则不然，这表明VCP可能是泛素化底物自噬降解的选择性必需物。事实上，大量累积的自噬囊泡含有泛素阳性内容物，这一特征在饥饿或巴非霉素a治疗后累积的自吞噬囊泡中未观察到，大LAMP-1和LAMP-2阳性空泡和LC3-II在IBMPFD患者的成肌细胞中的积聚。我们得出结论，VCP对含泛素的自噬体的成熟至关重要，这种功能的缺陷可能有助于IBMPFD的发病机制。

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数字

图1
图1。疾病相关VCP突变体不会导致泛素依赖性蛋白酶体降解的全面损害
（A） 用编码GFP标记的野生型VCP（VCP-wt）、VCP-R155H、VCP-A232E和显性阴性VCP（VC P-DN）的表达载体瞬时转染稳定表达泛素融合降解（UFD）底物UbG76V-YFP的Mel-Juso细胞。与VCP-DN突变体相比，VCP-wt和疾病相关突变体没有引起UbG76V-YFP底物的积累。作为对照，用10μM蛋白酶体抑制剂MG132处理未转染的UbG76V YFP Mel Juso细胞6小时。比例尺等于50μm。（B） 表达wt和突变VCP的UbG76V-YFP-Mel-Juso细胞中YFP荧光的定量。将未转染细胞的荧光强度值归一化。VCP-DN导致UbG76V YFP水平显著升高（**未配对t吨测试，P（P）< 0.001). 误差条表示标准偏差（n=30–150个单元格）。（C） 表达GFP标记wt和突变VCP的UbG76V-YFP-Mel-Juso细胞中YFP和GFP水平的散点图。（D） 用编码GFP标记的VCP-wt、VCP-R155H、VCP-A232E和VCP-DN的表达载体瞬时转染稳定表达ERAD底物CD3δ-YFP的Mel Juso细胞。VCP-wt和疾病相关突变体没有引起CD3δ-YFP底物的积累，而VCP-DN突变体导致CD3δ-YFP水平的普遍增加。比例尺等于50μm。误差线表示标准偏差。（E） 表达wt和突变VCP的CD3δ-YFP Mel Juso细胞中YFP荧光值的量化。VCP-DN导致CD3δ-YFP水平显著增加（**未配对t吨检验，p＜0.001）。误差条表示标准偏差（n=30–150个单元格）。（F） 表达GFP标记的wt和突变VCP的CD3δ-YFP Mel Juso细胞中YFP和GFP水平的散点图。
图2
图2。RNAi敲低VCP损伤自噬体成熟
（A） mCherry-EGFP-LC3b稳定MEF转染非靶向、Rab7或VCP siRNA。比例尺等于10μm。（B） 用非靶向或VCP靶向siRNA转染的细胞在基础条件下的自噬体和自噬溶酶体定量。*表明p<0.01；n.s.表示无显著差异，误差条表示标准误差。（C） ●●●●。针对MEF中非靶向和VCP靶向siRNA中VCP、p62和微管蛋白的免疫印迹。使用Li-Cor Odyssey系统同时观察p62和微管蛋白。（D） 用非靶向、VCP-靶向或Rab7-靶向siRNA转染细胞的微管蛋白对p62进行标准化量化。*表示p<0.01；**p<0.001；误差线表示三倍的标准偏差。
图3
图3。表达疾病相关VCP突变体的细胞自噬体成熟缺陷
（A） mCherry-EGFP-LC3b稳定MEF转染空载体或表达VCP-wt、VCP-DN、VCP-R155H或VCP-A232E。箭头表示大的LC3阳性囊泡。比例尺等于10μm。（B） 基础条件下每个细胞自噬体（黄色）和自噬溶酶体（红色）的定量。用空载体或VCP-wt、VCP-DN、VCP-R155H或VCP-A232E转染细胞。用巴非霉素（ev+Baf）处理空载体转染细胞。*表示p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。误差条表示标准误差。（C） 自噬囊泡（AV）在转染wt或突变型VCP的细胞中的大小分布。尺寸估算单位为μm。**表明p＜0.01。（D） 量化用空载体、wt-VCP或VCP突变形式转染的细胞中含有“超大”囊泡（即直径超过1.5μm）的细胞百分比。实验进行了两次，共三次。（E） VCP的突变形式导致HEK293T细胞中p62的积累。使用Li-Cor Odyssey系统对p62/兔子和微管蛋白/小鼠进行Western blot。（F） p62 Western-Blot的量化。p62定量标准化为微管蛋白定量。误差条表示三个独立副本的标准偏差。**表明p＜0.01。
图4
图4。在表达突变VCP的细胞中积聚的大LC3阳性囊泡被酸化并显示组织蛋白酶B活性
用GFP-LC3和野生型或突变型VCP共同转染细胞，然后用嗜酸染料LysoSensor Blue和组织蛋白酶B底物MR-（RR）2标记细胞。作为对照，表达VCP-wt的细胞也用Bafilomycin a处理。箭头显示用LysoSensor Blue和MR（RR）2标记的大GFP-LC3阳性囊泡。比例尺等于10μm。共转染效率的控制如补充图4所示。
图5
图5。在突变VCP表达细胞中积聚的大LC3阳性囊泡含有泛素阳性物质
（A） 在基础条件下（上面板）、Bafilomycin A处理后（中面板）或饥饿后（下面板）观察转染LC3-GFP和抗泛素免疫染色的细胞。（B） 用所示质粒和GFP-LC3共同转染细胞，然后用抗泛素（红色）免疫染色。比例尺等于10μm。箭头表示含有泛素阳性物质的LC3阳性囊泡。（C） 表示表达野生型或突变型VCP的细胞中含有泛素的自噬体百分比的图表。误差条表示三个独立副本的标准偏差。**指p<0005；***，p<0001。共转染效率分析见图4，放大倍数见图5，表明泛素染色为管腔染色。
图6
图6。IBMPFD患者成肌细胞显示大LAMP阳性小泡和LC3-II蛋白积聚
（A） 正常对照组或IBMPFD患者肌母细胞VCP和LAMP-1的免疫染色。用63倍物镜观察细胞。请参阅补充图6，了解来自其他患者的细胞系和其他标记物。（B） 来自2个对照样品和来自2个IBMPFD患者的样品的成肌细胞裂解物中LC3的蛋白质印迹分析。
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