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.2009年12月14日；187(6):875-88.
doi:10.1083/jcb.200908115。

含缬氨酸蛋白（VCP）是自噬所必需的，在VCP疾病中被破坏

郑善柱 1, 罗德里戈A Fuentealba, 萨拉·米勒, 艾琳·杰克逊, 大卫·皮尼卡·沃姆斯, 罗伯特·H·巴洛, 康拉德·C·威尔
附属公司

含缬氨酸蛋白（VCP）是自噬所必需的，在VCP疾病中被破坏

郑善柱等。 J细胞生物学. .

摘要

含缬氨酸蛋白（VCP）的突变会导致包涵体肌病（IBM）、佩吉特骨病和额颞叶痴呆（IBMPFD）。患者肌肉有退化纤维、边缘空泡（RV）和含有泛素和TDP-43（TARDNA结合蛋白43）的肌浆内含物。在本研究中，我们发现IBMPFD肌肉也积累了定位于RV的自噬体相关蛋白Map1-LC3（LC3）和p62/固存体。为了测试VCP是否参与自噬，我们沉默了VCP或表达了三磷酸腺苷失活的VCP。在基础条件下，VCP活性的丧失导致自噬体的积累。在自噬诱导后，这些自噬体不能成熟为自溶体并降解LC3。类似地，IBMPFD突变VCP在细胞和动物中的表达导致非降解自噬体的积累，这些自噬小体在RV处结合，无法降解聚集的蛋白质。有趣的是，TDP-43在自噬抑制后积聚在细胞液中，类似于IBMPFD突变表达后的情况。这些数据表明VCP参与自噬，并表明自噬受损解释了IBMPFD肌肉的病理学，包括TDP-43的积聚。

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数字

图1。
图1。
LC3和p62在IBMPFD肌肉组织中积聚。（A和B）来自具有p62（A）或LC3（B）抗体的对照（cont）或VCP-WT、-RH9或-RH12突变转基因系的9个月龄四头肌裂解物的免疫印迹。注意突变动物中p62和LC3II亚型的增加。密度定量来自6只9个月龄以上的动物/组。LC3和p62水平归一化为负载控制。误差条表示六个独立实验的标准误差。**，P<0.001。AU，任意单位。（C） 对9个月龄对照组、VCP-WT或两个VCP-RH转基因系之一（RH9或RH12）的胫骨前肌（TA）或股四头肌（Quad）进行p62免疫染色。注意p62在肌纤维中部或沿肌瓣下区域积聚。（D） 表达VCP-RH转基因小鼠股四头肌的组织化学和免疫组织化学。15个月大的RV动物的苏木精和伊红（H&E）染色，12个月大动物的RV的p62免疫染色，RV的LC3免疫染色，以及12个月的动物的LC3的肌下膜积聚。支架突出显示一个LC3阳性肌纤维。单根肌肉纤维轮廓为白色。（C和D）箭头表示p62或LC3的液泡或积聚。棒材，30µm。
图2。
图2。
LC3和p62在VCP-KD和IBMPFD突变表达细胞中积累。（A） 用VCP、LC3、p62或α-微管蛋白抗体免疫印迹打乱siRNA或VCP-靶向siRNA处理的U20S细胞的裂解物。密度分析由四个独立的实验用图形表示。LC3和p62水平归一化为负载控制。（B） 表达GFP-LC3的siRNA干扰控制（Scr）或VCP靶向siRNA KD细胞的荧光显微镜图像。计算GFP-LC3点/细胞的基本数量。（C） 来自稳定转染四环素诱导的U20S细胞的对照或myc标记的VCP-WT、ATP酶非活性VCP-EQ或两个IBMPFD突变体之一VCP-RH或-AE的裂解物表达16小时，并用myc、LC3、p62或α-微管蛋白抗体进行免疫印迹。密度分析由四个独立的实验用图形表示。LC3和p62水平归一化为负载控制。注意VCP siRNA KD和突变表达细胞中LC3II和p62的增加。（D） 四环素诱导的表达GFP-LC3的U20S细胞经Baf处理和不经Baf治疗4小时的荧光显微镜图像（DMSO对照[左]或Baf+[右]）。细胞为对照组U20S细胞和VCP-WT、-RH、-AE和-EQ。（E）计算了GFP-LC3 puncta/cell的数量，用于对照组U20 S和VCP-WG、-EQ、-RH和-AE，包括和不包括Baf，持续4小时（DMSO或Baf）。注意突变表达细胞中基础GFP-LC3点的增加。（A–C和E）误差条表示四个独立实验的标准误差。*，P<0.01；和**，P<0.001。棒材，25µm。
图3。
图3。
自噬体成熟需要功能性VCP。（A） 转染mRFP-GFP-LC3（tfLC3）并用雷帕霉素处理2小时以诱导自溶体形成的U20S或VCP-WT-、VCP-RH-、VCP-AE-或VCP-EQ表达细胞中GFP和mRFP的荧光图像。（B） siRNA对照（Scr）或VCP-KD或Baf处理的对照U20S细胞转染tfLC3并用雷帕霉素处理2小时以诱导自溶体形成。（A和B）开放箭头表示自噬体（GFP和mRFP荧光），而闭合箭头表示自溶体（mRFP仅荧光）。（C） 该图表示两个不同实验中10个独立的细胞场的GFP和mRFP共定位的皮尔逊系数。误差条表示两个独立实验中20个字段的标准误差。*，P<0.001。（D） U20S或四环素诱导的VCP-WT、-RH或-AE细胞经载体或Baf处理4 h后的裂解产物，并免疫印迹LC3和α-微管蛋白。请注意，Baf处理不会增加IBMPFD突变（RH和AE）表达细胞中的LC3II水平。棒材，15µm。
图4。
图4。
自噬蛋白降解需要功能性VCP。（A） 通过营养剥夺0、2或4小时的自噬诱导和LC3和α-微管蛋白的免疫印迹，来自siRNA处理的U20S细胞（争夺对照[Scr]或VCP siRNA KD）的裂解物。LC3II在对照中随时间降解，但在KD细胞中不降解。显示了两个实验中的一个。（B） U20S或四环素诱导的VCP-WT、-EQ、-RH或-AE细胞经0、2、4或6小时营养剥夺和LC3和α-微管蛋白免疫印迹诱导自噬后的裂解物。LC3II在对照组和VCP-WT中降解，但在表达突变（EQ、RH或AE）的细胞中降解效率较低。（C） 三个独立实验中每个时间点LC3II和α-微管蛋白密度测定评估的图形表示。
图5。
图5。
自噬体降低了IBMPFD突变表达细胞中溶酶体标记的定位。（A） 转染GFP-LC3并用雷帕霉素处理2小时以诱导自溶体形成的VCP-WT-、VCP-RH-、VCP-AE-或VCP-EQ表达细胞的GFP-LC2（LC3）和LTR的表观荧光图像。开放箭头突出显示自溶体（GFP和LTR共定位），闭合箭头显示自噬体（仅GFP）。（B） 两个不同实验中10个独立的细胞场的GFP和LTR皮尔逊系数共定位。（C） U20S、VCP-WT–、VCP-RH–、VC P-AE–或VCP-EQ–表达细胞或与转染GFP-LC3的Baf共处理的U20S细胞，经雷帕霉素处理2小时以诱导自溶体形成的GFP-LC2和内源性Lamp1免疫组化的表观荧光图像。箭头突出显示自溶体（GFP和Lamp1共定位）。（A和C）合并字段中的方框区域在相邻面板中被放大。（D） 在两个不同的实验中，来自10个独立的细胞场的GFP和Lamp1的Pearson系数共定位。（B和D）误差条表示两个独立实验中20个字段的标准误差。*，P<0.001。（E） 四环素诱导的对照细胞或表达VCP-WT-、VCP-RH-或VCP-AE-的U20S细胞诱导16小时，然后用雷帕霉素处理2小时的电子显微镜观察。注意在突变表达细胞系中自噬结构的积累。箭头表示自噬结构。棒材：（A和C）15µm；（E） 1微米。
图6。
图6。
自噬和溶酶体标记定位于IBMPFD组织中的RV。（A） 使用p62和Lamp1或-2抗体的股四头肌免疫荧光图像。显示了9个月龄VCP-WT小鼠的股四头肌切片、年龄匹配的VCP-RH转基因、12个月龄的VCP-RH转基因和IBMPFD患者的肌肉活检。打开的箭头突出显示p62和Lamp1/2共定位，而关闭的箭头仅显示p62免疫荧光区域。合并面板中概述了包含RV的单个肌纤维。（B和C）来自12个月大表达VCP-RH的转基因小鼠的两个独立系（B显示RH12，C显示RH9系）之一的胫骨前肌的透射电子显微镜。请注意核周或茎鞘下的大液泡状结构。棒材：（A）30µm；（B和C）500纳米。
图7。
图7。
IBMPFD小鼠肌肉自噬底物降解受损。（A） 分别在电穿孔（基线）后2天或在营养剥夺（饥饿）24小时后，在右侧和左侧胫骨前部使用polyQ80（Q80）-或polyQ19荧光素酶（Q19），使用对照或IBMPFD突变RH-表达小鼠（RH12）体内生物发光的代表性图像。polyQ80-荧光素酶/polyQ19-荧光素酶的比率显示在每个图像集的下方。数值单位为×104每秒每平方厘米每斯特拉迪安的光子数。（B） 饥饿24小时后，对照组、VCP-WT或两个VCP-RH（RH12或RH9）转基因小鼠系之一的左右胫骨前肌中polyQ80-荧光素酶/polyQ19-荧光素酶活性比率变化（Δ）的方框图和胡须图。图表代表每组三只动物。与对照动物或VCP-WT转基因动物相比，RH12的p值分别为0.05和0.06。与对照或VCP-WT转基因相比，RH9的p值为0.03。将RH12和RH9组合动物分别与对照组或VCP-WT组进行比较时，p值分别为0.01和0.02。对照组和VCP-WT组之间没有统计学差异。
图8。
图8。
IBMPFD突变表达或自噬抑制将TDP-43重新分配到细胞内的胞浆中。（A） 来自两个独立实验的10个不同领域的对照U20S、VCP-WT、VCP-RH、VCP-AE或VCP-EQ表达细胞或用10µM Baf或50µM氯喹（Chlq）处理4小时的对照U20 S细胞中mCherry–TDP-43分布（仅核或细胞质）的定量。误差条表示两个独立实验中20个字段的标准误差。*，与表达VCP-WT的细胞相比，P<0.02。（B） 对照U20S、VCP-WT、VCP-RH或VCP-AE表达细胞或用Baf或氯喹处理4小时的对照U20S细胞中mCherry–TDP-43（红色）和DAPI（蓝色）的荧光图像。箭头表示胞浆TDP-43和核周TDP-43内含物。（C，顶部）mCherry–TDP-43–转染VCP-WT–、VCP-RH–、VC P-AE–或VCP-EQ–表达细胞的核或细胞溶质裂解物部分的TDP-43、层粘连蛋白A/C和肌动蛋白的免疫印迹。注意，IBMPFD突变型和EQ表达细胞的胞浆TDP-43增加。（底部）用30µg/ml（cq1）或120µg/ml（cq2）二磷酸氯喹或200 ng/ml Baf处理的mCherry–TDP-43或类似转染细胞转染的未处理U20S细胞的核或细胞溶质裂解物部分的TDP-43、层粘连蛋白A/C和肌动蛋白的免疫印迹。数据代表了三个独立的实验。棒材，15µm。
图9。
图9。
IBMPFD突变表达或自噬抑制将TDP-43重新分配到小鼠骨骼肌中的胞浆中。（A） 15个月龄对照组（Cont）或VCP-WT、-RH9或-RH12转基因小鼠股四头肌骨骼肌的TDP-43免疫染色。单个肌纤维轮廓为白色。（B） 用生理盐水或50 mg/kg/d腹腔注射氯喹（Chlq）治疗4周的3月龄小鼠股四头肌骨骼肌的TDP-43免疫染色。（A和B）插图显示每个场有一个肌核。棒材，30µm。
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引用人

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