Simplified, enhanced protein purification using an inducible, autoprocessing enzyme tag

doi:10.1371/journal.pone.0008119

.2009年12月2日；4（12）：e8119。

doi:10.1371/journal.pone.0008119。

使用可诱导的自动处理酶标签简化、增强蛋白质纯化

沈爱美（Aimee Shen）¹, 帕特里克·卢帕德斯, 蒙塞·莫雷尔, 伊丽莎白·L·庞德, 马苏德·萨达吉亚尼, K克里斯托弗·加西亚, 马修·博吉

附属公司

PMID： 19956581
预防性维修识别码：项目经理2780291
内政部： 10.1371/日志.pone.0008119

使用可诱导的自动处理酶标签简化、增强蛋白质纯化

沈爱美（Aimee Shen）等。公共科学图书馆一号. 2009.

.2009年12月2日；4（12）：e8119。

doi:10.1371/journal.pone.0008119。

作者

沈爱美（Aimee Shen）¹, 帕特里克·卢帕德斯, 蒙塞·莫雷尔, 伊丽莎白·L·庞德, 马苏德·萨达基亚尼, K克里斯托弗·加西亚, 马修·博吉

附属

¹美国加利福尼亚州斯坦福大学斯坦福医学院病理学系。

PMID： 19956581
预防性维修识别码：项目经理2780291
内政部： 10.1371/journal.pone.0008119

摘要

我们介绍了一种使用高度特异、可诱导、自切割蛋白酶标签纯化细菌中表达的重组蛋白的新方法。该标签由霍乱弧菌MARTX毒素半胱氨酸蛋白酶结构域（CPD）组成，CPD是一种自动处理酶，在靶蛋白-CPD连接处的亮氨酸残基后才裂解。重要的是，霍乱弧菌CPD是由六磷酸肌醇（InsP（6））特异性激活的，这是一种真核生物特异性小分子，不存在于细菌胞浆中。因此，当His（6）标记的CPD融合到靶蛋白的C末端并在大肠杆菌中表达时，可以使用金属离子亲和色谱从细菌裂解液中纯化全长融合蛋白。随后将InsP（6）加入固定的融合蛋白中，在靶蛋白CPD连接处诱导CPD介导的切割，将未标记的靶蛋白释放到上清液中。该方法将亲和层析和融合标签切割浓缩为一个步骤，避免了添加外源蛋白酶以去除融合标签的需要，提高了标签分离的效率。此外，我们的结果表明，CPD纯化系统除了具有省时、通用和廉价的特点外，还可以增强来自不同生物体的难降解蛋白质的表达、完整性和溶解性。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：A.S.、P.J.L.、K.C.G.和M.B.在描述CPD净化系统技术的临时专利申请中被列为发明人。该专利不会改变作者对PLoS ONE数据和材料共享政策的遵守。与作者出版物相关的材料和信息将按要求免费提供给学术、非商业研究人员。

数字

**图1。CPD融合蛋白纯化系统。**
（A）使用CPD纯化靶蛋白的示意图，在文本中详细描述。（B） CPD融合蛋白示意图。显示了分别由SalI位点编码的P4和P3残基Val和Asp，以及CPD中包含的剩余P2-P4′残基。主要位置是指高压灭菌现场的残留物C端，用黑色垂直线标出。如图2所示，自动处理后附加到目标蛋白C末端的残基的组成可以在1到4个残基之间变化。目前，CPD系统的功能是作为目标蛋白的C末端融合，从而补充了现有的方法，其中亲和标记只能作为N末端融合应用。

**图2。pET-CPD表达载体示意图。**
弯曲箭头，T7启动子，卵圆形（RBS），核糖体结合位点，绿色矩形，靶蛋白，灰色矩形，CPD，*霍乱弧菌*MARTX（aa.3440–3650），深灰色矩形，ΔP1-CPD，*霍乱弧菌*MARTX（aa.3442–3650），最深灰色矩形，ΔP2′-CPD，*霍乱弧菌*MARTX（aa.3444-3650），黑色矩形，他的₆-标签，白色矩形，HA-tag。虚线和箭头表示CPD解理位置。在CPD介导的裂解后添加到目标蛋白C末端的残基，以及相关的限制性位点如图所示（附加到目标蛋白的C末端的限制性位置编码的残基以下划线表示）。添加到目标蛋白C末端的残基的组成可以根据克隆位置和使用的pET-CPD载体而变化。应注意，pET22b-CPD显示的P1-Leu_巴姆HI-Leu必须编码在目标基因的3′克隆引物中（即在目标插入物的末端添加Leu密码子）。使用pET22b和pET28a载体主干构建CPD表达载体。

**图3。用CPD-His纯化GFP₆标签。**
（A）考马斯染色法纯化GFP的SDS-PAGE分析。GFP-CPD-His公司₆与镍结合²⁺-NTA树脂与越来越多的InsP孵育₆在4°C下持续2小时。收集释放到上清液中的GFP（InsP₆上清液）；镍²⁺-然后通过加入200mM咪唑从树脂中洗脱结合的蛋白质（咪唑洗脱）。通过SDS-PAGE分析收集的组分。（B） InsP上清液中释放GFP的目视分析₆添加到固定化GFP-CPD-His₆融合蛋白。

**图4。CPD不会在固有的非结构化蛋白质中分裂。**
gp130细胞内结构域（ICD）-CPD-His₆或gp130（ICD）-他的₆与镍结合²⁺-NTA树脂与100µM InsP孵育₆室温下2小时；树脂清洗四次，然后洗脱镍²⁺-200 mM咪唑结合蛋白质。纯化组分通过SDS-PAGE和考马斯染色进行分析。CL、清除的裂解物、FT、流通、IP6、从InsP洗脱₆孵化。

**图5。相对于GST标记，CPD改善了生物素连接酶的表达。**
融合到CPD-His的生物素连接酶（BirA，35kDa）纯化的SDS-PAGE分析₆或GST-His₆使用考马斯染色法。伊斯₆-与镍结合的标记蛋白质²⁺-NTA树脂与50µM InsP孵育₆在室温下保持1小时，并将树脂洗涤三次，然后洗脱Ni²⁺-200 mM咪唑结合蛋白质。CL、清除的裂解物、+、IPTG诱导培养、FT、流通、IP6、从InsP洗脱₆孵化。

**图6。他的比较₆-从中删除标记*恶性疟原虫*SENP1使用相对于CPD的凝血酶。**
（A）考马斯染色的SDS-PAGE分析*恶性疟原虫*使用CPD-His纯化的SENP1（PfSENP1，25 kDa）₆或他的₆-亲和标签。PfSENP1-CPD-His公司₆或他的₆-PfSENP1与Ni结合²⁺-NTA树脂与100µM InsP孵育₆室温下2小时；将树脂洗涤三次，并收集洗涤馏分。镍²⁺-通过添加200 mM咪唑洗脱结合蛋白，IPTG诱导培养、CL、清除裂解物、E、咪唑在InsP前洗脱₆添加，IP6，在InsP之后洗脱₆孵化。（B）紫外痕量PfSENP1在His作用下通过凝胶过滤色谱进一步纯化₆-标签移除。插图，PfSENP1纯化凝胶过滤部分的考马斯染色。凝血酶是指凝血酶介导的N末端His去除后纯化的PfSENP1₆-标记，而InsP₆指InsP₆-诱导、CPD介导的C末端CPD-His的清除₆-标签。添加到生成的PfSENP1蛋白的残基显示：GSHM在凝血酶裂解后添加到PfSENP1的N末端，而VDAL在InsP后添加到CfSENP的C末端₆-活化CPD裂解）。（C）对His期间采集的组分进行SDS-PAGE分析的考马斯染色₆-凝血酶孵育前的PfSENP1纯化（–），凝血酶孵育12小时后的PfSENP1纯化（+），以及消减IMAC去除未清除的His后的纯化₆-PfSENP1（镍²⁺-NTA）。PfSENP1的产量随着每次实验操作而降低。

**图7。CPD可以提高靶蛋白的稳定性。**
STIM1（氨基酸342–469，14kDa）的Crac激活域（CAD128）表达于*大肠杆菌*融合到CPD-His₆或GST His₆.星号表示GST-STIM1（CAD）-他的₆衍生降解产物。伊斯₆-与镍结合的标记蛋白质²⁺-NTA树脂与50µM InsP孵育₆在室温下清洗树脂1小时，然后洗脱镍²⁺-通过200mM咪唑结合蛋白质。CL、清除的裂解物、+、IPTG诱导培养、FT、流通、IP6、从InsP洗脱₆孵化。

**图8。相对于His，CPD提高了小鼠巨噬细胞金属弹性蛋白（MMP12）的溶解度₆-地缘标记。**
（A） His的SDS-PAGE分析₆-使用考马斯染色标记MMP12。MMP12与His融合₆-标记的CPD和与His相关的融合蛋白的表达₆-比较标记的MMP12。星号表示与MMP12共同纯化的推测伴侣蛋白_VDAL公司.对角箭头表示His₆-标记截短的MMP12产物，在从包涵体纯化MMP12期间也观察到。伊斯₆-与镍结合的标记蛋白质²⁺-NTA树脂与50µM InsP孵育₆在室温下清洗树脂1小时，然后洗脱镍²⁺-200 mM咪唑结合蛋白质。CL、清除的裂解物、+、IPTG诱导培养、FT、流通、IP6、从InsP洗脱₆孵育、E、咪唑在InsP前洗脱₆此外。（B） MMP12的额外纯化_VDAL公司凝胶过滤色谱法。插入，考马斯染色SDS-PAGE分析MMP12凝胶过滤部分_VDAL公司（C）MMP12活性测定。变性条件下纯化并复性（MMP12（复性））和MMP12的活性_VDAL公司使用CPD系统（CPD方法）与标准荧光底物进行纯化比较。相对于重折叠方法，观察到通过CPD方法纯化的MMP12的荧光底物切割速率可比较。

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