Phosphorylation of serine 205 by the protein kinase CK2 persists on Pax3-FOXO1, but not Pax3, throughout early myogenic differentiation

doi:10.1021/bi9012947

比较研究

.2009年12月15日；48(49):11786-95.

doi:10.1021/bi9012947。

蛋白激酶CK2对丝氨酸205的磷酸化作用在Pax3-FOXO1上持续存在，但在早期肌源性分化中不存在Pax3

凯文·迪茨¹, 帕特里克·J·米勒, 安德鲁·德·霍伦巴赫

附属公司

PMID： 19904978
预防性维修识别码： PMC2790557型
内政部： 10.1021/bi9012947

比较研究

蛋白激酶CK2对丝氨酸205的磷酸化作用在Pax3-FOXO1上持续存在，但在早期肌源性分化中不存在Pax3

凯文·迪茨等。生物化学. 2009.

.2009年12月15日；48(49):11786-95.

doi:10.1021/bi9012947。

作者

凯文·迪茨¹, 帕特里克·J·米勒, 安德鲁·德·霍伦巴赫

附属

¹美国路易斯安那州新奥尔良玻利瓦尔街533号路易斯安那州立大学健康科学中心遗传学系，邮编：70112。

PMID： 19904978
预防性维修识别码： PMC2790557型
内政部： 10.1021/bi9012947

摘要

肌源性转录因子Pax3在早期骨骼肌发育中起着重要作用，是肺泡横纹肌肉瘤（ARMS）的关键成分，ARMS是一种儿童固体肌肉肿瘤。ARMS的特征是t（2；13）染色体易位，导致5'Pax3序列与3'FOXO1序列融合，编码致癌融合蛋白Pax3-FOXO1。磷酸化等翻译后修饰是转录因子调节的常见机制。与此相一致，我们在之前的报告中证明，Pax3在增殖但未分化的原代成肌细胞中磷酸化于Ser205。然而，介导这种磷酸化事件的激酶尚待确定。此外，尚不清楚Pax3-FOXO1是否在该位点磷酸化，也不知道融合蛋白的磷酸化在早期肌源性分化过程中如何变化。在本报告中，我们确定CK2（以前称为“酪蛋白激酶II”）是负责在增殖的小鼠原代成肌细胞中磷酸化Ser205处Pax3和Pax3-FOXO1的激酶。此外，我们证明，与野生型Pax3相比，在早期肌源性分化过程中，Pax3-FOXO1上Ser205的磷酸化持续存在。最后，我们发现Pax3-FOXO1在多种含有易位的ARMS细胞系的Ser205处磷酸化。本报告中的结果不仅表明了Pax3-FOXO1失调可能导致肿瘤发生的机制，而且还确定了治疗ARMS的新靶点。

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数字

图1
Ser205存在于CK2共有氨基酸序列中。A） Pax3和Pax3-FOXO1示意图。结构域如下：成对DNA结合域（PD）由斑点框表示，八肽域（OD）由黑框表示，同源域（HD）由条纹框表示，对分的FOXO1 DNA结合域由交叉阴影框表示。显示了Pax3和FOXO1转录激活域（TAD）。填充的圆圈表示Ser205磷酸化的位置。B） CK2一致序列和Ser205周围区域的氨基酸序列。星号表示磷酸化氨基酸，位置（n+3）处带下划线的残基表示CK2共识序列中最关键的氨基酸。

图2
酪蛋白激酶II磷酸化Ser205上的Pax3。将细菌表达和纯化的GST（27kD）、GST-Pax3（74kD）或GST-Pax2（S205A）（80kD）磷酸化*在体外*使用实验程序中描述的纯化CK2（A和B）或增殖原代成肌细胞总细胞提取物（C和D）。磷酸化蛋白从树脂中洗脱，用8%SDS-PAGE分离，并通过Coomasie染色（A和C，左面板）、放射自显影（A和C，中面板和右面板）或使用我们的磷酸特异性抗Pax3（p205）抗体（12）（B和D）的Western blot分析进行可视化。面板A和C中的箭头表示GST（下箭头）、GST-Pax3（中箭头）和GST-Pax1（S205A）（上箭头）的主要蛋白质种类。所有其他可观察到的蛋白质种类都是降解产物，在这些蛋白质制剂中常见。

图3
酪蛋白激酶II特异性抑制剂可防止Pax3在Ser205的磷酸化。将细菌表达和纯化的GST-Pax3磷酸化*在体外*如实验程序所述，使用之前在有或无越来越多常用CK2抑制剂DRB（顶面板）或肝素（底面板）的情况下培养的增殖小鼠原代成肌细胞总细胞提取物。使用我们的抗Pax3（p205）抗体（12）进行蛋白质印迹分析以观察Ser205的磷酸化状态，并进行考马斯染色以确认等量蛋白质的存在。凝胶下的数字表示最大磷酸化百分比，相对于对照组测定，提供了近似IC₅₀DRB和肝素分别为10μM和1μM。

图4
Pax3-FOXO1在增殖的小鼠原代成肌细胞的Ser205上磷酸化。A）用氨基末端FLAG表位标记的Pax3（第1和第3道）或FLAG表位标记的Pax3-FOXO1（第2和第4道）稳定转导的增殖小鼠原代成肌细胞经代谢标记为[³⁵S] -蛋氨酸（泳道1和2），以标记所有细胞蛋白质，或[³²P] -正磷酸盐（通道3和4），仅标记磷酸化蛋白质。使用抗FLAG M2磁性树脂从总细胞提取物中免疫沉淀产生的标记蛋白质，从树脂中释放蛋白质，用12%的SDS-PAGE分离，并通过放射自显影术检测放射性标记物种，如实验程序所述。蛋白质种类较少[³²P] -相对于[³⁵S] -蛋氨酸样品，因为并非所有蛋白质物种都以磷酸蛋白的形式存在。B）从用氨基末端FLAG表位标记的Pax3-FOXO1稳定转导的增殖小鼠原代成肌细胞中分离出总细胞提取物。用8%SDS-PAGE分离所得提取物，并使用抗Pax3或磷酸特异性抗Pax4（p205）进行Western blot分析。

图5
Pax3-FOXO1在Ser205上被CK2磷酸化。将细菌表达和纯化的GST（27kD）、GST-Pax3（74kD）或GST-Pax3-FOXO1（125kD）磷酸化*在体外*使用实验程序中描述的纯化CK2（A和B）或增殖原代成肌细胞总细胞提取物（C和D）。磷酸化蛋白从树脂中洗脱，用8%SDS-PAGE分离，并通过Coomasie染色（A和C，左面板）、放射自显影（A和C，中面板和右面板）或使用我们的磷酸特异性抗Pax3（p205）抗体（12）（B和D）的Western blot分析进行可视化。面板A和C中的箭头表示GST（下箭头）、GST-Pax3（中箭头）和GST-Pax3-FOXO1（上箭头）的主要蛋白质种类。面板B和D中的箭头表示GST-Pax3（下箭头）和GST-Pax3-FOXO1（上箭头）的主要蛋白质种类。所有其他可观察到的蛋白质种类都是降解产物，在这些蛋白质制剂中常见。

图6
酪蛋白激酶II特异性抑制剂阻止Pax3-FOXO1在Ser205的磷酸化。将细菌表达和纯化的GST-Pax3-FOXO1磷酸化*在体外*如实验程序所述，使用之前在有或无越来越多常用CK2抑制剂DRB（顶面板）或肝素（底面板）的情况下培养的增殖小鼠原代成肌细胞总细胞提取物。使用我们的抗Pax3（p205）抗体（12）进行Western blot分析，以可视化Ser205的磷酸化状态，并进行考马斯染色，以确认存在等量的蛋白质。凝胶下的数字表示最大磷酸化百分比，相对于对照组测定，提供了近似IC₅₀DRB和肝素分别为6M和0.5M。

图7
Ser205的磷酸化在整个肌源分化过程中持续存在于Pax3-FOXO1上，但不存在于Pax3上。如前所述，诱导用FLAG-Pax3-FOXO1稳定转导的小鼠原代成肌细胞或成肌细胞分化（12）。在诱导分化后的不同时间点分离总细胞提取物（小时），并使用针对Pax3（抗Pax3）的抗体对等量的总细胞提取物进行Western blot分析，以确定Pax3的定性存在或Ser205的磷酸化[抗Pax4（p205）]（12）。

图8
在多种人类ARMS细胞系中，Pax3-FOXO1在Ser205被磷酸化。如实验程序所述，从多种人类ARMS细胞系中分离出总细胞提取物。在两个单独的实验（实验#1–RH3和RH30；实验#2–RH4、RH28和RH41）中，使用针对Pax3（抗Pax3）的抗体对等量的总细胞提取物进行标准Western blot分析，以确定Pax3-FOXO1的定性存在。在完全剥离后，使用Ser205磷酸化特异性抗体[抗Pax3（p205）]重新探测印迹。

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