Clonality of mouse and human cardiomyogenesis in vivo

doi:10.1073/pnas.0903089106

.2009年10月6日；106(40):17169-74.

doi:10.1073/pnas.0903089106。 Epub 2009年9月17日。

小鼠克隆性与人在体心肌发生

细田东郎¹, 多梅尼科·德阿马里奥, 毛里西奥·卡斯特罗·卡布拉尔·达·席尔瓦, 郑汉桥, M Elena Padin-Iruegas公司, 芭芭拉·奥戈雷克, 乔·费雷拉·马丁斯, Saori Yasuzawa-Amano公司, 天野克也, 岩田北彦, 魏成, 马塞罗·罗塔, Konrad Urbanek公司, 扬·卡伊斯图拉, 比罗·安韦萨, 安娜罗莎·莱里

附属公司

PMID： 19805158
预防性维修识别码： PMC2761310型
内政部： 10.1073/pnas.0903089106

小鼠克隆性与人在体心肌发生

细田东郎等。美国国家科学院程序. 2009.

.2009年10月6日；106(40):17169-74.

doi:10.1073/pnas.0903089106。 Epub 2009年9月17日。

作者

细田东郎¹, 多梅尼科·达马里奥, 毛里西奥·卡斯特罗·卡布拉尔·达·席尔瓦, 郑汉桥, M Elena Padin-Iruegas公司, 芭芭拉·奥戈雷克, 乔·费雷拉·马丁斯, Saori Yasuzawa-Amano公司, 天野克也, 岩田北彦, 魏成, 马塞罗·罗塔, Konrad Urbanek公司, 扬·卡伊斯图拉, 比罗·安韦萨, 安娜罗莎·莱里

附属

¹美国马萨诸塞州波士顿哈佛医学院布里格姆女子医院麻醉科，邮编02115。

PMID： 19805158
预防性维修识别码： PMC2761310型
内政部： 10.1073/pnas.0903089106

摘要

对心脏前体细胞（CPC）克隆性和体内心肌细胞周转的分析需要对未分化细胞进行遗传标记，以便在特定后代中追踪单个母细胞的克隆标记。用携带EGFP的慢病毒感染小鼠心房和心尖的CPC小生境，1-5个月后确定标记细胞的命运。在分离的CPC、心肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞中发现了一个共同的整合位点，记录了CPC的自我更新和多潜能以及分化细胞群的克隆起源。随后，在注射后2-4天评估CPC的EGFP-病毒感染程度，并在6个月后测量表达报告基因的心肌细胞数量。此外，还引入了BrdU脉冲相位方案，作为分析心肌细胞周转的附加分析方法。在6个月的时间里，每个EGFP阳性的CPC分裂大约8次，产生230个心肌细胞；该值与BrdU标记的新形成细胞数一致。为了确定人类CPC（hCPC）是否具有自我更新和多能性，用EGFP-lentivirus转导这些细胞，并在免疫抑制大鼠急性心肌梗死后注射。从再生心肌中采集的hCPC、心肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞在人类基因组中显示出常见的病毒整合位点。因此，我们的研究结果表明，成人心脏中含有调节心脏稳态和修复的常驻干细胞池。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

**图1。**
原位CPC的遗传标记。(一)心脏壁龛包含七个CPC（c-kit，白色）。两个CPC用EGFP标记（绿色，箭头）。可见一个EGFP阳性心肌细胞（α-肌动蛋白，α-SA，红色）（星号）。(B类)共表达EGFP和c-kit（CPC）、EGFP与CD31（EC）以及EGFP、Thy1.2/CD90（成纤维细胞）的细胞的散点图。还显示了前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）。双阳性细胞被反向门控，并在FSC/SSC图中用彩色点描绘。

**图2。**
小鼠体内CPC的克隆标记。(一)心肌细胞（Myo）、内皮细胞（EC）和成纤维细胞（Fbl）中α-MHC（Myh6）、CD31和前胶原（Col3a1）的转录物。通过两轮或三轮巢式PCR检测c-kit的转录。MC，小鼠心肌；β-肌动蛋白。(*B–E类*)FACS分选的心肌细胞表达c-kit(B类，绿色），α-SA(C类，红色），CD31(D类，黄色），或前胶原(E类，洋红）。(F类)注射EGFP-lentivirus 4个月后，在从小鼠心脏分离的CPC、EC、Fbl和Myo中鉴定出四个不同的克隆。相同分子量的带对应于宿主基因组中前病毒序列整合的相同位点。（参见中的图S4SI附录用于小鼠基因组和序列的克隆定位）。

**图3。**
CPC与心肌发生。(一)FISH检测EGFP阳性（绿色）心肌细胞（α-SA，红色）中发现的EGFP病毒整合物（细胞核中的白点）。矩形中的区域在插图中以较高的放大倍数显示。(B类)6个月时，左心室中段的EGFP标记的心肌细胞也呈BrdU阳性（白色箭头）。可见一个EGFP阳性BrdU阴性心肌细胞（星号）。*，*P（P）*与BrdU阳性心肌细胞相比，<0.05。(C类)大多数BrdU阳性（白色）LV心肌细胞不表达EGFP（箭头）。存在少量BrdU阳性EGFP阳性心肌细胞（双箭头）。CPC表达c-kit（洋红色），并用BrdU标记（箭头）。矩形中的区域在较低的面板中以较高的放大率显示。***，*P（P）*与房室沟（AVG）和中区（mid）相比，分别<0.05。

**图4。**
验证BrdU标签。(一和B类)BrdU标记核的光谱分析。详见正文。(C类)BrdU和EdU标记的肌细胞的分数。(*D–F型*)BrdU（白色）和EdU（绿色）共存于梗死边缘区的心肌细胞核（箭头所示）。

**图5。**
培养hCPC的病毒标记与心肌再生。(一)从EGFP阳性HCPC中提取基因组DNA，进行三轮PCR。第一（1）轮PCR导致DNA涂片，第二（2）轮PCR识别出七条带。相同颜色的箭头指向不同车道中的相应带。第三轮（第三轮）后，5′-侧产物的扩增子的大小减少了112 bp，3′-侧产品的扩增子大小减少了138 bp。这七条带反映了EGFP慢病毒在人类基因组中整合的不同位点。PCR产物扩增（Re-amp）并测序。在本例中，黄色和粉色箭头所示的两条带的铰孔产品如图S10所示一在里面*SI附录*用于序列）。(B类)在培养的hCPC中鉴定出多个克隆（见图S10B类和C类在里面*SI附录*用于染色体定位和序列）。(C类)左心室梗死区内的再生心肌带（箭头）。新形成的心肌细胞表达α-SA（上面板，红色）和EGFP（中央面板，绿色）。下部面板，上部和中央面板的合并。备用心肌细胞（*）。

**图6。**
再生心肌中hCPC的克隆追踪。(一)从再生心肌分离的表达c-kit、CD31和CD146的EGFP阳性细胞的散点图。(B类)在一只治疗大鼠再生心肌的不同心肌细胞群中检测到各种克隆（见图S13SI附录用于染色体定位和序列）。(C类)孤立细胞群中的整合位点。一些克隆对于不同的细胞类别是通用的（相同颜色的箭头）。关键DNA序列比相应的克隆带短约80 bp。

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