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.2009年7月；5(7):484-93.
doi:10.1038/nchembio.183。 Epub 2009年5月24日。

Akt激活的抑制剂劫持

大久达也 1, 多萝西娅·菲德勒, 张超（Chao Zhang）, 丹尼尔·格雷, 布莱恩·艾岑斯坦, 兰迪·霍夫曼, 凯文·M·肖卡特
附属公司

Akt激活的抑制剂劫持

大久弥达也等。 自然化学生物. 2009年7月.

摘要

激酶Akt作为多种生长因子输入信号的调节器发挥着核心作用，因此使其成为一个有吸引力的抗癌药物靶点。A-443654是一种ATP-竞争性Akt抑制剂。出乎意料的是，用A-443654处理细胞会导致Akt在其两个调节位点（Thr308和Ser473）发生反常的过度磷酸化。我们探讨了A-443654抑制因子诱导的Akt过度磷酸化是否是通路水平反馈调节中断的结果，还是抑制剂与Akt的ATP结合位点结合的直接结果。Akt的催化失活突变体表明，在没有任何途径反馈效应的情况下，抑制剂与Akt ATP位点的结合足以直接导致激酶的过度磷酸化。我们得出结论，ATP-竞争性Akt抑制剂传递其靶激酶Akt的调节性磷酸化。这些结果为Akt激活的自然调节和进入临床的Akt抑制剂提供了新的见解。

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数字

图1
图1。实现Akts特异性抑制的化学遗传策略
(一)野生型Akt抑制与作为Akt抑制。A-443654抑制内源性Akt的所有三种亚型（左），而作为Akt特异性抑制剂如PrIDZ和3-IB-PP1仅抑制相应的作为Akt亚型，可在细胞中过度表达（右）。(b条)化学结构和在体外Akt抑制剂对所有三种Akt亚型的抑制活性。这个作为Akt抑制剂特异性阻断作为Akt活动。集成电路50数值由在体外myr-HA的IP激酶分析-重量Akt1/2/3和myr-HA-作为Akt1/2/3在HEK293T细胞中表达。(C类)Akt2与A-443654的共晶结构（PDB:2JDR）28Akt2和A-443654中的守门人蛋氨酸以棒状表示。颜色如下：淡蓝色、碳纤维；红色，氧气；蓝色、氮气；黄色，硫磺。
图2
图2。细胞效应作为Akt转染和作为Akt特异性抑制剂处理
(一)HEK293细胞需要血清过夜，然后用PrINZ、A-443654或3-IB-PP1处理20分钟，然后用50 ng/ml IGF-1刺激10分钟。通过免疫印迹分析细胞裂解物的Akt（Thr308，Ser473）和GSK3β（Ser9）磷酸化。(b条)用myr-HA转染HEK293细胞-重量Akt1/2/3或myr-HA-作为公元1/2/3年。通过免疫印迹分析细胞裂解液中的Akt（Ser473和Thr308）和GSK3β（Ser9）磷酸化。(c（c）)HA转染HEK293细胞-作为用连续稀释的PrINZ或3-IB-PP1处理Akt1 30分钟。通过免疫印迹法分析细胞裂解物的Akt（Thr308，Ser473）磷酸化。(d日)HA转染HEK293细胞-作为用2.5µM PrINZ或10µM 3-IB-PP1处理Akt1/2/3 30 min。通过免疫印迹法分析细胞裂解物的Akt（Thr308，Ser473）磷酸化。
图3
图3。Akt抑制剂诱导的Akt过度磷酸化上游调控因子的药理学和遗传解剖
(一)分析了生理性Akt激活的调节因子包括：1）PI3K，它产生PIP3，用于Akt向膜的PH域募集；2） PDK1，磷酸化Thr308；和3）mTORC2，磷酸化Ser473。PI3K、PDK1和mTORC2分别被抑制：PIK90、BX-795和PP242。(b条)HA转染HEK293细胞-作为用2.5µM PIK90处理Akt1/2/3 10 min，然后再添加2.5µM PrINZ 30 min。通过免疫印迹分析细胞裂解液中的Akt（Thr308，Ser473）磷酸化。(c（c）)用任一HA转染的HEK293细胞-作为Akt1或HA-作为Akt1公司R25C型用2.5µM PrINZ处理30分钟。通过免疫印迹法分析细胞裂解液的Akt（Thr308，Ser473）磷酸化。(d日)myr-HA转染HEK293细胞-作为用2.5µM PrINZ处理Akt1 30分钟。通过免疫印迹分析细胞裂解液中的Akt（Thr308，Ser473）磷酸化。(e（电子）)HA转染HEK293细胞-作为在额外添加2.5µM PrINZ 30分钟之前，用10µM BX-795处理Akt1/2/3 10分钟。通过免疫印迹分析细胞裂解液中的Akt（Thr308，Ser473）磷酸化。(（f）)HA转染HEK293细胞-作为用2.5µM PP242处理Akt1/2/3 10 min，然后再添加2.5µM PrINZ 30 min。通过免疫印迹分析细胞裂解液中的Akt（Thr308，Ser473）磷酸化。
图4
图4。过度磷酸化独立于Akt信号转导，由与Akt结合的抑制剂引起
(一)激酶活性myr-HA转染HEK293细胞-作为myr-HA的Akt1/2或激酶死亡（KD）形式-作为用2.5µM PrINZ或10µM 3-IB-PP1处理Akt1/2 30 min。通过免疫印迹分析细胞裂解物的Akt（Thr308，Ser473）和GSK3β（Ser9）磷酸化。(b条)激酶活性HA转染HEK293细胞-作为HA的Akt1或激酶死亡（KD）形式-作为用2.5µM PrINZ或10µM 3-IB-PP1处理Akt1 30分钟。通过免疫印迹分析细胞裂解液中的Akt（Thr308，Ser473）和GSK3β（Ser9）磷酸化。(c（c）)预期结果示意图外在的和内在的Akt对PrIDZ治疗和HA联合转染的调控-作为Akt1和旗帜-重量如果通路介导的反馈导致Akt过度磷酸化（激酶外在的)然后同一细胞中的所有Akt分子包括HA-作为Akt1和旗帜-重量Akt1应同样过磷酸化。相反，如果ATP位点的占有是过度磷酸化的唯一决定因素（激酶内在的)则只有Akt能够结合药物（HA-作为Akt1）应过磷酸化。(d日)HA共转染HEK293细胞-作为Akt1和旗帜-重量用不同浓度的PrINZ处理Akt1 30 min。细胞裂解物通过以下两种方法进行免疫沉淀反对的-HA或反对的-flag抗体，然后通过免疫印迹分析免疫沉淀物的Akt（Thr308，Ser473）磷酸化。
图5
图5。Akt抑制剂A-443654诱导Akt膜定位
在以下所述的各种条件下处理HEK293细胞后，用兔抗Akt或鼠抗pAkt（p308）固定并染色细胞，然后用Alexa 488-共轭山羊抗兔和Alexa 568-共轭羊抗鼠，并用荧光显微镜检查。用载体（DMSO）处理细胞15分钟（顶面板），用2.5µM A-443654处理细胞15 min（中面板），或在添加2.5µM-443654之前，用2.5μM PIK90处理细胞10 min（底面板）。比例尺10µm。
图6
图6。高磷酸化Akt是高活性的在体外Akt抑制剂解离后
HA转染HEK293细胞-作为在有或无血清的情况下培养Akt1过夜，然后用2.5µM PrIDZ处理30分钟，然后用IGF-1（50 ng/ml）刺激10分钟-作为从细胞裂解物中免疫沉淀Akt1，并测定Akt活性。数据表示为平均值±SEM（n=8）和IGF-1刺激HA的相对值-作为Akt1活性。通过免疫印迹分析免疫沉淀物的Akt（Thr308，Ser473）磷酸化。
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中的注释

  • 抑制剂会引发激酶，这很矛盾。
    Frye SV，Johnson GL。 Frye SV等人。 自然化学生物。2009年7月；5(7):448-9. doi:10.1038/nchembio.f.11。 自然化学生物。2009. PMID：19465930 没有可用的摘要。

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