A novel direct homogeneous assay for ATP citrate lyase

doi:10.1194/jlr.D900008-JLR200

.2009年10月；50(10):2131-5.

doi:10.1194/jlr。D900008-JLR200。 Epub 2009年3月12日。

一种新的直接均相检测ATP柠檬酸裂解酶的方法

马正平¹, 清顺楚, 董成

附属公司

PMID： 19286649
预防性维修识别码：项目经理2739766
内政部： 10.1194/jlr。D900008-JLR200

一种新的直接均相检测ATP柠檬酸裂解酶的方法

马正平等。脂质研究杂志. 2009年10月.

.2009年10月；50(10):2131-5.

doi:10.1194/jlr。D900008-JLR200。 Epub 2009年3月12日。

作者

马正平¹, 清顺楚, 董成

附属

¹美国新泽西州普林斯顿市布里斯托尔-迈尔斯施贵宝公司代谢研究、研发部，邮编08543-5400。

PMID： 19286649
预防性维修识别码：项目经理2739766
内政部： 10.1194/jlr。D900008-JLR200

摘要

ATP柠檬酸裂解酶（ACL）是一种细胞溶质酶，以柠檬酸、辅酶a和ATP为底物，Mg（2+）为必要辅因子，催化乙酰辅酶a（CoA）和草酰乙酸的合成。乙酰辅酶A的ACL依赖性合成被认为是脂肪酸和胆固醇从头合成的必要步骤。因此，抑制ACL一直是治疗血脂异常和肥胖的一种策略。传统上，ACL酶活性是通过与苹果酸脱氢酶或氯霉素乙酰转移酶等酶偶联来间接测量的。然而，在本报告中，我们描述了一种直接测量ACL酶活性的新方法。我们首先确定了一种简便的方法，在不使用MicroScint-O检测[（14）C]柠檬酸盐的情况下特异性检测[（14-C]乙酰-CoA。使用该检测系统，我们设计了一种简单、直接和均匀的384孔板格式ACL分析，适合高通量筛选。当前的分析包括1）ACL酶与[（14）C]柠檬酸盐和其他底物/辅因子CoA、ATP和Mg（2+）的孵育，2）EDTA淬火，3）添加MicroScint-O，该试剂专门检测产品[（14。这种独特的ACL分析可以更有效地识别新的ACL抑制剂，并允许对ACL/抑制剂相互作用进行详细的机械表征。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
信号分化[¹⁴C] 乙酰辅酶A和[¹⁴C] MicroScint-O中的柠檬酸盐[¹⁴C] 柠檬酸盐或[¹⁴C] 将乙酰辅酶A与稀释缓冲液（87 mM Tris，pH 8.0，20μM MgCl）混合₂，10 mM KCl，7.5 mM DTT）。双方的最后具体活动[¹⁴C] 柠檬酸盐和[¹⁴C] 乙酰辅酶A为0.67μCi/μmol。A：向每个孔中添加等分的60μl MicroScint-O。在室温下摇晃平板过夜后，用TopCount检测到信号。B：将4ml EcoLite LSC添加到每个闪烁瓶中，并在液体闪烁计数器中进行计数。

**图2。**
载体蛋白对ACL活性的影响。ACL反应在缓冲液D中进行，如材料和方法所示。50 ng或100 ng人ACL和150μM的等分样品[¹⁴C] 柠檬酸盐（0.67μCi/μmol）在37°C下与不同浓度的载体蛋白或稳定剂孵育不同时间。用24 mM EDTA停止反应后，向每个孔中添加总共60μl MicroScint-O。在室温下摇晃平板过夜后，用TopCount检测到信号。

**图3。**
ACL酶滴定和反应时间过程。ACL反应在150μM缓冲液D中进行[¹⁴C] 柠檬酸盐（2μCi/μmol）和不同量的人ACL在37°C下持续不同时间。

**图4。**
底物浓度依赖于人类ACL反应。ACL反应在含有30 ng人ACL和以下底物的缓冲液D中进行：A:0.1 mM CoA、1 mM ATP和各种浓度的[¹⁴C] 柠檬酸盐（2μCi/μmol）；B： 1 mM ATP，150μM[¹⁴C] 柠檬酸盐（2μCi/μmol）和各种浓度的CoA；C： 0.1 mM CoA，150μM[¹⁴C] 柠檬酸盐（2μCi/μmol）和各种浓度的ATP。反应在37°C下进行3小时。

**图5。**
BMS-303141对ACL的浓度依赖性抑制曲线。ACL反应在含有150μM的缓冲液D中进行[¹⁴C] 柠檬酸盐（2μCi/μmol）、30 ng人ACL和各种浓度的BMS-303141。最终DMSO浓度为2.5%。反应在37°C下进行3小时。

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