CDC25B mediates rapamycin-induced oncogenic responses in cancer cells

doi:10.1158/0008-5472.CAN-08-3222

.2009年3月15日；69(6):2663-8.

doi:10.1158/0008-5472.CAN-08-3222。 Epub 2009年3月10日。

CDC25B介导雷帕霉素诱导的癌细胞致癌反应

陈润强¹, 青凯阳, 炳文路, 魏毅, 格雷格·坎廷, 陈燕玲, 科琳·费恩斯, 约翰·耶茨（John R Yates）第三, Jiing-Dwan Lee先生

附属公司

PMID： 19276368
预防性维修识别码： PMC2697620型
内政部： 10.1158/0008-5472.CAN-08-3222

CDC25B介导雷帕霉素诱导的癌细胞致癌反应

陈润强等。癌症研究. 2009.

.2009年3月15日；69(6):2663-8.

doi:10.1158/0008-5472.CAN-08-3222。 Epub 2009年3月10日。

作者

陈润强¹, 杨庆凯, 炳文路, 魏毅, 格雷格·坎廷, 陈燕玲, 科琳·费恩斯, 约翰·R·耶茨第三, Jiing-Dwan Lee先生

附属

¹美国加利福尼亚州拉霍亚斯克里普斯研究所免疫学和微生物科学系。

PMID： 19276368
预防性维修识别码： PMC2697620型
内政部： 10.1158/0008-5472.CAN-08-3222

摘要

由于雷帕霉素（mTOR）通路的哺乳动物靶点在人类癌症中通常被解除管制，因此，雷帕霉素抑制剂、雷帕霉素及其衍生物正在癌症临床试验中进行积极测试。临床最新研究表明，这些药物的抗癌效果有限，可能是由于雷帕霉素依赖性诱导致癌级联反应的机制尚不清楚。因此，我们研究了雷帕霉素依赖性磷酸蛋白质组学，发现161个细胞蛋白中的250个磷酸位点对雷帕霉素敏感。其中，雷帕霉素调节四种激酶和四种磷酸酶。这些蛋白的siRNA-依赖性筛选表明，雷帕霉素诱导的AKT被细胞CDC25B磷酸酶耗竭而减弱。雷帕霉素诱导丝氨酸375处CDC25B的磷酸化，将该位点突变为丙氨酸大大降低了CDC25B磷酸酶的活性。此外，CDC25B（S375A）的表达抑制了雷帕霉素对AKT的激活，表明CDC25B的磷酸化对CDC25B的活性及其转导雷帕霉素诱导的致癌AKT活性的能力至关重要。重要的是，我们还发现各种癌症细胞系中CDC25B的缺失增强了雷帕霉素的抗癌作用。总之，利用雷帕霉素磷酸蛋白质组学，我们不仅提高了对雷帕霉素作用的全球机制的理解，而且还表明CDC25B可以作为改善mTOR靶向癌症治疗的药物靶点。

PubMed免责声明

数字

**图1。雷帕霉素依赖性磷酸蛋白质组分析的实验设计**
(一)用25 nM雷帕霉素预处理“重”细胞1小时，然后用10 ng/ml EGF处理15分钟。“轻”细胞仅用10 ng/ml EGF处理15分钟。重细胞裂解物和轻细胞裂解物按1:1的比例混合。通过使用CENSUS程序测量质谱中轻肽和重肽的峰面积来量化每个肽的磷酸化。共检测到6179个磷酸位点。(b条)RPS6重磷酸肽和轻磷酸肽的色谱图（R.RLS*S*LRAS*TSK.S）显示，雷帕霉素依赖性抑制作用是面积比的8.33倍。红线：经EGF处理的重磷酸肽；蓝线：经EGF和雷帕霉素处理的轻磷酸肽。(**c（c）**)细胞裂解物的Western blot分析显示，通过所示的处理，使用抗磷-p70S6K（S389）、抗磷-ERK1/2（T202/Y204）和抗磷-RPS6 S235/S236抗体修改了ERK1/2、p70S6K和RPS6蛋白的磷酸化。GAPDH被用作负荷控制。

**图2。雷帕霉素依赖性磷酸蛋白组分析结果及雷帕霉素调节蛋白活性和功能分类**
(一)雷帕霉素磷酸蛋白质组学中检测到的磷酸肽的面积比（AR）分布。(b条)雷帕霉素磷酸蛋白质组学中鉴定的磷酸位点、磷酸肽和磷蛋白综述。(**c（c）**)根据雷帕霉素调节蛋白的生物活性和(d日)通过他们的细胞功能。（这两个图表中分别排除了94个和99个没有已知活性或功能的雷帕霉素调节蛋白）。

**图3。CDC25B介导雷帕霉素激活致癌AKT途径**
(一)CDC25B缺失对癌细胞系中雷帕霉素激活AKT的影响。将CDC25B特异性智能池siRNA（SP）、双链siRNA（DP）或对照siRNA转染细胞60小时。然后用100 nM雷帕霉素处理细胞3小时。免疫印迹法检测AKT（S473）、eIF4E（S209）、S6K1（T389）的磷酸化以及CDC25B和GAPDH蛋白的表达(b条)用空载体（EV）或编码Myc-tagged野生型（WT）或突变CDC25B的表达质粒转染HEK293细胞，其丝氨酸375突变为丙氨酸（S375A）。转染后48小时，收集细胞，并按照材料和方法中的描述评估EV、WT和S375A的磷酸酶活性。使用WT转染细胞对这些细胞的相对磷酸酶活性进行标准化，其值取100%。(**c（c）**)将EV或编码WT或突变CDC25B、CDC25B（S375A）的表达质粒转染到细胞中，然后进行100 nM雷帕霉素刺激。免疫印迹法检测AKT（S473）、S6K1（T389）的磷酸化以及CDC25B和GAPDH蛋白的表达。

**图4。CDC25B介导雷帕霉素对p38MAP激酶的激活**
(一)细胞p38的耗竭对雷帕霉素激活AKT没有影响。将p38特异性、CDC25B特异性或对照siRNA转染细胞60小时，然后用100 nM雷帕霉素处理15分钟。通过免疫印迹检测AKT、S6K1、p38、CDC25 B的磷酸化。GAPDH蛋白作为负荷控制。(b条)CDC25B缺失减弱了雷帕霉素对p38的激活。将CDC25B特异性siRNA或对照siRNA转染细胞60小时，然后用100 nM雷帕霉素处理15分钟。免疫印迹法检测p38（T180/Y182）、S6K1（T389）的磷酸化和CDC25B的表达。

**图5。CDC25B细胞耗竭增强雷帕霉素的抗癌作用**
CDC25B缺失增强了雷帕霉素在不同癌细胞系中的生长抑制作用。用CDC25B特异性siRNA或对照siRNA转染细胞24小时，然后用100 nM雷帕霉素再处理48小时，如图所示。活细胞计数通过MTT分析估算。%根据仅转染对照siRNA的细胞的MTT值计算生长抑制。

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