H2AZ is enriched at polycomb complex target genes in ES cells and is necessary for lineage commitment

doi:10.1016/j.cell.2008.09.056

.2008年11月14日；135(4):649-61.

doi:10.1016/j.cell.2008.09.056。 Epub 2008年11月6日。

H2AZ在ES细胞中富集于多梳复合物靶基因，是谱系承诺所必需的

Menno P Creyghton公司¹, 斯泰利亚尼·马库拉基, 斯图亚特·斯莱文, 雅各布·汉纳, 迈克尔·洛达托, 基沙, 理查德·A·杨, 鲁道夫·杰尼什, 劳里·A·博伊尔

附属公司

PMID： 18992931
预防性维修识别码：项目经理2853257
内政部： 2016年10月10日/j.cell.2008.09.056

H2AZ在ES细胞中富集于多梳复合物靶基因，是谱系承诺所必需的

Menno P Creyghton公司等。单元格. 2008.

.2008年11月14日；135(4):649-61.

doi:10.1016/j.cell.2008.09.056。 Epub 2008年11月6日。

作者

Menno P Creyghton公司¹, Styliani Markoulaki女士, 斯图亚特·斯莱文, 雅各布·汉纳, 迈克尔·洛达托, 基沙, 理查德·A·杨, 鲁道夫·杰尼什, 劳里·A·博伊尔

附属

¹怀特黑德生物医学研究所，9剑桥中心，剑桥，马萨诸塞州，邮编02142。

PMID： 18992931
预防性维修识别码：项目经理2853257
内政部： 2016年10月10日/j.cell.2008.09.056

摘要

阐明染色质如何影响基因表达模式并最终影响细胞命运是理解发育和疾病的基础。组蛋白变体H2AZ已成为染色质功能的关键调节因子，在哺乳动物发育过程中起着重要但未知的作用。这里，全基因组分析显示，H2AZ以与Polycomb group（PcG）蛋白Suz12非常相似的方式占据发育重要基因的启动子。通过使用RNAi，我们证明了H2AZ在调节靶基因表达中的作用，发现H2AZ和PcG蛋白在启动子处的占据是相互依赖的，进一步表明H2AZ对ES细胞分化是必要的。值得注意的是，H2AZ在谱系承诺细胞中占据不同的基因子集，这表明其动态再分配对于细胞命运的转变是必要的。因此，H2AZ和PcG蛋白可以在ES细胞中建立适当执行发育基因表达程序所必需的特殊染色质状态。

PubMed免责声明

数字

**图1。H2AZ在ES细胞中占据启动子区**
（A）使用染色质免疫沉淀（ChIP）和启动子微阵列分离的H2AZ占据的DNA序列的代表性示例。将具有核心组蛋白H3的ChIP与H2AZ杂交以控制核小体密度。请注意，H2AZ ChIP-DNA与体染色质杂交作为输入在一组重复实验中产生了非常相似的结果。图中显示了基因组区域内所有探针的未处理富集比率（蓝色）。染色体位置来自小鼠基因组的NCBI构建34（mm6）。基因在图中按比例显示。转录的开始和方向都用箭头表示。（B）结合探针与最近转录起始位点（TSS）之间的距离分布。数据是所有富集基因在-4 kb至+4 kb基因组区域内每个寡核苷酸探针的平均未处理富集比率。（C） H2AZ使用ChIP和贴片染色体19微阵列占据DNA序列的典型示例。图中显示了基因组区域内所有探针的未处理富集比率（蓝色）（ChIP与组蛋白H3）。基因在图下方按比例显示，如（A）所示。（D）富含H2AZ基因生物过程的基因本体分析。本体术语在y轴上表示，对于x轴上的每个类别，相对于微阵列上表示的所有基因，结合基因富集的p值显示。

**图2。H2AZ和Suz12在ES细胞中占据一组高度相似的基因**
（A）维恩图显示了富含H2AZ并被Suz12占据的基因在ES细胞中的重叠，这是由ChIP结合启动子阵列确定的。使用高置信度阈值标准，93%的H2AZ富集基因也被Suz12占据。（B）H2AZ和Suz12富集区根据启动子微阵列确定的结合区长度进行分类。大多数结合区小于2kb，而小部分（约15%）的结合域大于4kb。（C） H2AZ和Suz12在目标基因上显示相同的空间模式。图中显示了基因组区域内所有探针的H2AZ（蓝色）和Suz12（绿色）未处理富集比率，如图1A所示。（D） H2AZ和Suz12占据了跨越包含HOX基因簇的多个相邻基因的大域（>100kb）。数据来自启动子微阵列，该启动子微阵也被设计为包含平铺整个HoxA基因座的探针。显示了该区域内所有探针的H2AZ（蓝色）和Suz12（绿色）的未处理富集率。灰色条表示基因簇的大致位置。（E） H2AZ和Suz12在ES细胞的靶基因中显示出高度相似的空间模式。使用Cluster算法执行K-means聚类(http://rana.standord.edu/软件)以及一组1655个富含H2AZ的基因。每个水平线代表一个单独的基因，区域内每个探针的H2AZ（蓝色）和Suz12（绿色）富集值（相对于TSS为3.5 kb到+3.5 kb）用颜色强度表示（颜色越深表示富集率越高）。

**图3。H2AZ在神经前体中富含一组不同的基因**
（A） H2AZ从使用ChIP和启动子微阵列分离的重复实验集中占据DNA序列的代表性示例。将具有核心组蛋白H3的ChIP与H2AZ杂交以控制核小体密度。图中显示了基因组区域内所有探针在ES细胞（蓝色）和NP（红色）中H2AZ的未处理富集比率，如图1A所示。（B）与ES细胞相比，NP中H2AZ的空间分布不同。根据启动子微阵列数据，根据结合区的长度，将ES细胞（蓝色）和NP（红色）中H2AZ富集区进行装箱。（C） H2AZ富集于NP中的活性基因。ES细胞和NP中H2AZ或H3K27me3富集相关基因表达的累积分布图。ES细胞（黑色）和NP（灰色）中所有基因的累积分布作为参考。Affymetrix表达和H3K27me3富集数据来自Mikkelsen等人，2007。

**图4。RNA干扰介导的ES细胞H2AZ缺失**
（A） H2AZ发夹靶向序列的示意图（红色）以及H2A和H2AZ之间的同源性。（B）通过定量实时PCR在H2AZ缺失ES细胞系相对于对照ES细胞系中测量到RNAi介导的H2AZ抑制后，mRNA水平显著降低。数据被归一化为Gapdh，误差条代表2个标准偏差。（C）通过免疫印迹分析确定的H2AZ蛋白丰度在耗尽的ES细胞系中特异性降低，而在对照细胞系中未观察到组蛋白H2A或Oct4水平降低。Actin用作加载控件。（D）对照组和H2AZ缺乏的ES细胞株的ES细胞集落形态和Oct4水平相似。

**图5。H2AZ是控制靶基因表达所必需的**
靶基因在RNA干扰介导的抑制ES细胞中H2AZ后表现出去表达的倾向。实时PCR分析H2AZ缺失ES细胞中富集（绿色）或未富集（橙色）基因的mRNA水平。将数据归一化为Gapdh，并显示相对于对照ES细胞系的数据。反应一式三份，误差条代表平均值的2个标准偏差。

**图6。H2AZ和Polycomb复合物在ES细胞靶启动子上的相互依赖定位**
ChIP结合实时PCR检测（A）对照组Suz12（绿色条）或H2AZ缺失ES细胞（紫色条），（B）对照组H2AZ（绿色条*苏兹12*所示基因启动子区的空白ES细胞（紫色条）和（C）Rnf2/Ring1b对照（绿色条）或H2AZ缺失ES细胞（紫条）。所有ChIP-qPCR反应一式三份进行，误差条代表平均值的2个标准偏差。引物设计用于扩增TSS 1 kb范围内的区域，如表S13所示。Tcf3和Oct4（Pou5f1）代表阴性对照。在两个H2AZ缺失的ES细胞系中也获得了类似的结果。

**图7。H2AZ对ES细胞分化是必需的**
（A）来自对照组（上面板）或H2AZ缺失（下面板）ES细胞的切片第10天类胚体（EB）的苏木精和伊红染色。（B）对从对照组（黑条）或H2AZ缺失EB（灰条）中分离的mRNA进行实时PCR，以检测指示基因。相对mRNA水平归一化为Gapdh。显示的天数表明在RNA分离之前EB在培养中保持的时间。最右边的面板显示了Oct4和Nanog水平的终点比较。反应一式三份，误差条代表2个标准偏差。使用两种H2AZ缺失的ES细胞株也获得了类似的结果。（C）面板显示在缺乏维甲酸（左面板）或存在维甲酸（右面板）的情况下培养7天的EB图像。上部面板显示控制单元，而下部面板表示源自H2AZ缺失ES单元的EB。箭头表示维甲酸诱导分化的典型神经元样结构的形成。（D） EB中神经分化标记物Sox1和Nestin mRNA水平的实时PCR，如（C）所示。反应一式三份，误差条代表2个标准偏差。使用两种H2AZ缺失的ES细胞株也获得了类似的结果。

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1. Azuara V、Perry P、Sauer S、Spivakov M、Jörgensen HF、John RM、Gouti M、Casanova M、Warnes G、Merkenschlager M、Fisher AG。多能细胞系的染色质特征。自然细胞生物学。2006;8:532–538.-公共医学
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